自然調節(jié)性T細胞通過修飾前炎癥應答介導腦型瘧疾的發(fā)生.pdf

1、實驗目的
　　 瘧疾感染是當今威脅人類健康的主要難題之一,每年有一百多萬兒童死于瘧疾。腦型瘧疾(cerebral malaria,CM),簡稱腦瘧,是瘧疾最嚴重的并發(fā)癥之一,而且是瘧疾感染的主要死因。CM嚴重性的決定因素尚不完全清楚,但很可能來自宿主和寄生蟲兩方面。最終,寄生蟲和免疫應答的相互作用決定宿主感染結局。因此,關于CM發(fā)生免疫機制的基礎研究是研制有效抗瘧疫苗和藥物的前提。
　　 伯氏瘧原蟲(Plasmodium

2、 berghei ANKA,P.bANKA)鼠瘧與人類疾病有許多共同特征,是現有CM的最佳模型。目前研究認為CM是由腦血管內感染紅細胞(parasitized red blood cells,pRBC)粘附和細胞因子及效應細胞介導的強烈的宿主前炎癥應答的結合效應引起的疾病。相關研究表明活化T細胞介導的免疫應答參與疾病誘導,并且CD4+T細胞和CD8+T細胞均可促進腦病變發(fā)生。事實上,Th1應答在控制蟲血癥方面發(fā)揮關鍵作用,同時也促進CM

3、發(fā)生。
　　 CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Tregs)是不同于Th1和Th2的具有免疫調節(jié)效應的T細胞亞群。Tregs活化是寄生蟲逃避宿主免疫的機制之一。前期試驗已證明Tregs活化與約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelii 17XL,P.yoelii 17XL)感染鼠的易感性相關,Tregs可通過修飾樹突狀細胞(Dendritic cells,DCs)應答,誘導IL-10產生和C

4、D4+T細胞凋亡調控Th1應答。為此本研究動態(tài)觀察了正常感染鼠及Tregs消除鼠前炎性細胞因子,抗炎性細胞因子表達水平和Tregs增殖變化,以期闡明Tregs在腦瘧發(fā)生中的作用地位及其相關機制。
　　 實驗方法
　　 1、實驗動物模型構建及CM病變評估
　　 6-8w,雌性C57BL/6經腹腔感染1x106P.bergheiANKA寄生的紅細胞(pRBC)構建CM易感模型,感染BALB/c和DBA/2鼠構建CM抵

5、抗模型。實驗組(6只/組)和對照組(6只/組)小鼠于感染前1d和感染后1d分別經腹腔注射1mganti-CD25mAb(7D4,rat IgM；Bio Express)和等體積phosphate-buffered saline(PBS)構建Tregs消除小鼠模型。感染后6天起每日監(jiān)測鼠兩次,評價臨床實驗腦瘧(Experimental cerebral malaria,ECM)癥狀,用以下癥狀確定ECM得分:皮毛豎起、顫抖、肢體癱瘓、痙攣

6、、昏迷。每出現一個癥狀給予1分,累計得分≥4分者考慮為重型瘧疾。
　　 2、流式細胞術檢測脾細胞懸液中CD4+T細胞群內CD4+CD25+Foxp3+Tregs的百分含量
　　 分別于感染前和感染后第3d、5d、8d常規(guī)無菌取出小鼠脾臟,用0.17mol/LNH4Cl裂解紅細胞,以含10％胎牛血清(Fetal calf serum,FCS)的RPMI1640調整脾細胞終濃度為1 x107/ml。每份樣品用FITC-con

7、jugated anti-mouse CD4/L3T4(GK1.5；BD Pharmingen),APC-conjugated anti-mouse CD25/IL-2 receptor alpha(PC61；BDPharmingen)和PE-conjugated anti-Foxp3(clone FJK16s；eBioscience)進行三色分析,另設陰性對照管。在流式細胞儀專用染色管中加入新鮮制備的1x107/ml脾細胞懸液0.1m

8、l,并用FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體孵育以阻斷熒光抗體的非特異染色,再加入抗CD4-FITC和抗CD25-APC mAb進行表面染色,固定透膜后,用抗Foxp3-PE mAb進行胞漿內染色,用含1％FCS的PBS洗滌兩次并懸浮于500μlPBS中,流式細胞儀(Becton Dickinson,USA)進行檢測。以前向和側向散射角確定淋巴細胞群,CD4+T細胞畫門,分析計算CD4+T細胞群CD4+CD25+Foxp3+Tregs的百分率。

9、　　 3、采用雙抗體夾心ELISA法檢測脾細胞培養(yǎng)上清IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-17、IL-10及Griess方法檢測NO2-含量
　　 (1)脾細胞樣品制備分別于感染前和感染后第3d,5d,8d常規(guī)無菌取出小鼠脾臟,用0.17mol/L NH4Cl裂解紅細胞。以含10％FCS的RPMI1640調整脾細胞終濃度為1 x107/ml,于24孔培養(yǎng)板中,每孔加入500μl脾細胞懸液于37℃,5％CO2條件下培養(yǎng)48h

10、。需要注意的是天然脾細胞與純化NA/LE hamster anti-mouse CD3e(145-2C11,BD Pharmingen,0.56μl/well)和純化NA/LE hamster anti-mouse CD28(37.51,BD Pharmingen,0.112μl/well)于37℃,5％CO2條件下共同培養(yǎng)48h以刺激IL-17產生,隨后收集培養(yǎng)上清,-80℃保存,待細胞因子及NO檢測。
　　 (2)雙抗體夾心

11、ELISA試劑盒分別檢測脾細胞培養(yǎng)上清IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17的分泌水平,酶標儀測定450nm處OD值。結果以試劑盒提供的標準品繪制標準曲線,應用SoftMax Pro 4.3.1Ls軟件分析,計算細胞因子含量(pg/ml)。
　　 (3)Griess方法檢測脾細胞培養(yǎng)上清中NO2-含量100μl上清和Griess反應液100μl室溫反應10min,用NaNO2作為標準品,酶標儀檢測550nm處O

12、D值。
　　 實驗結果
　　 1、感染率、幸存率與疾病評估
　　 腦瘧是通過給C57BL/6小鼠注射毒性P.bANKA血液階段寄生蟲誘導的,C57BL/6小鼠于感染后8-11天死于麻痹和昏迷,蟲血癥為10-20％。相比而言,抵抗型BALB/c和DBA/2小鼠經歷類似的寄生蟲生長但不發(fā)生腦病變,于感染后3-4W死于貧血和過度蟲血癥(>60％)。從腦瘧癥狀的臨床得分來看,C57BL/6小鼠得分高于BALB/c和DBA

13、/2小鼠。
　　 2、易感和抵抗小鼠感染期間脾細胞培養(yǎng)上清前炎性細胞因子、抗炎性細胞因子和NO水平的動態(tài)檢測
　　 CM易感C57BL/6鼠和抵抗BALB/c與DBA/2鼠脾細胞培養(yǎng)上清前炎性細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-17及NO于感染后開始升高,感染后5天達峰值,感染后8天下降(C57BL/6鼠呈現輕微下降)。三種鼠脾細胞培養(yǎng)上清抗炎性細胞因子IL-10也于感染后5天達峰值,在感染后8天C57BL/

14、6鼠IL-10水平顯著下降,抵抗BALB/c與DBA/2鼠IL-10水平輕微下降。易感鼠脾細胞培養(yǎng)上清前炎性細胞因子和NO水平顯著高于抵抗鼠,而IL-10水平顯著低于抵抗鼠。
　　 3、易感和抵抗小鼠感染后不同時間點脾CD4+T細胞中Tregs的百分比和絕對數
　　 CM易感鼠和抵抗鼠脾臟CD4+T細胞中Tregs百分比和絕對數于感染后開始升高,感染后3天達峰值,感染后5天到8天逐漸下降。并且在感染期間,C57BL/6鼠

15、脾臟CD4+T細胞中Tregs百分比和絕對數顯著低于BALB/c和DBA/2小鼠。
　　 4、體內CD25消除后Tregs效應分析
　　 CD25消除的C57BL/6、BALB/c和DBA/2小鼠脾臟CD4+T細胞中Tregs百分數顯著低于相應對照鼠。與正常感染鼠相比,Tregs消除的C57BL/6鼠幸存率明顯增加,感染后5、6、7天感染率顯著下降,CM癥狀的臨床得分也相應減少,CD25消除的C57BL/6鼠不發(fā)生腦瘧癥

16、狀,于感染后3-4周死于貧血和過度蟲血癥。CD25消除的BALB/c和DBA/2鼠與正常感染鼠感染過程相似,但在感染初期蟲血癥得到暫時控制,CD25消除后8天Tregs快速恢復,抑制T細胞活化,不能控制蟲血癥,這些鼠于感染后3-4周死于過度蟲血癥和嚴重貧血。CD25消除明顯逆轉IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-17、IL-10及NO產生。CD25消除的DBA/2小鼠與CD25消除的BALB/c小鼠的感染進程和細胞因子產生過程相似。

17、
　　 5、易感和抵抗鼠感染后不同時間Tregs與IFN-γ、TNF-α、NO及IL-10與蟲血癥的相關性分析
　　 腦瘧易感鼠和抵抗鼠感染期間Tregs數量與IFN-γ、TNF-α、NO產生呈負相關,IL-10產生與蟲體血癥水平正相關。
　　 結論
　　 1、前炎癥應答和抗炎癥應答之間平衡的設立對控制重型瘧疾發(fā)生至關重要,Tregs是維持此平衡的重要調節(jié)因子。
　　 2、Tregs通過修飾前炎癥