豬苓活性成分通過調(diào)節(jié)HuR介導(dǎo)T24細(xì)胞增殖抑制和凋亡.pdf

1、目的：
　　豬苓是藥用真菌，具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤功能等作用，臨床應(yīng)用于膀胱癌的治療取得了較好療效，但其作用機(jī)制尚未完全闡明。豬苓的主要化學(xué)成分是多糖和甾體類，另外還有蛋白質(zhì)、生物素等。本實(shí)驗(yàn)主要研究豬苓活性成分通過調(diào)節(jié)HuR介導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞增殖抑制和凋亡的機(jī)制。通過實(shí)驗(yàn)達(dá)到如下目的:
　　1、研究HuR能否調(diào)控T24細(xì)胞BCL-2 mRNA轉(zhuǎn)錄后表達(dá)。
　　2、研究豬苓多糖能否通過HuR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)途徑調(diào)控T2

2、4細(xì)胞BCL-2基因的表達(dá)。
　　3、研究麥角甾醇能否通過HuR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)途徑調(diào)控T24細(xì)胞cyclin D1基因的表達(dá)。
　　方法：
　　1、研究HuR過表達(dá)對T24細(xì)胞BCL-2 mRNA轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的調(diào)節(jié)
　　T24細(xì)胞用無抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照組（未做任何處理）、陰性對照組（用陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染）、HuR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（用HuR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染）。用Western blotting

3、檢測各組HuR的表達(dá)，檢驗(yàn)過表達(dá)的效果。
　　構(gòu)建HuR過表模型，于過表達(dá)HuR后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)用放線菌素D(Actinomycin D)終止RNA的合成，并于處理后的0h、2h、4h、6h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別收集細(xì)胞提取RNA，以RT-PCR的方法檢測BCL-2mRNA的半衰期，研究HuR過表達(dá)對T24細(xì)胞BCL-2 mRNA穩(wěn)定性的影響。
　　構(gòu)建HuR過表達(dá)模型，于過表達(dá)HuR后24h用RT-PCR測定BCL-2 mRNA表達(dá)，

4、用Western blotting檢測BCL-2蛋白的表達(dá)，分析HuR過表達(dá)后BCL-2 mRNA和蛋白表達(dá)量的變化。
　　2、研究HuR沉默對T24細(xì)胞BCL-2 mRNA轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的調(diào)節(jié)
　　T24細(xì)胞用無抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，用siHuR轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照組（未做任何處理）、陰性對照組（加入陰性對照siRNA）、siHuR處理組（加入針對HuR編碼區(qū)的siRNA）。轉(zhuǎn)染24h后，用Act

5、inomycin D終止RNA的合成，后按預(yù)定時(shí)間點(diǎn)檢測BCL-2mRNA的含量，并計(jì)算其半衰期，研究HuR沉默對T24細(xì)胞BCL-2mRNA穩(wěn)定性的影響。
　　構(gòu)建構(gòu)建HuR基因沉默模型，用RT-PCR測定HuR基因沉默對T24細(xì)胞BCL-2mRNA表達(dá)的影響，用Western blotting檢測HuR基因沉默對T24細(xì)胞BCL-2蛋白的表達(dá)的影響。
　　3、研究豬苓多糖(polyporus polysaccharide

6、，PPS)通過HuR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)途徑調(diào)控T24細(xì)胞BCL-2基因的表達(dá)
　　T24細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后分4組，對照組（正常培養(yǎng)的細(xì)胞，未做任何處理）、PPS低劑量組（加入50μg/mL PPS）、PPS中劑量組（加入100μg/mL PPS）、PPS高劑量組（加入200μg/mL PPS）。
　　在進(jìn)行細(xì)胞藥理實(shí)驗(yàn)前，采用MTT法繪制細(xì)胞生長曲線，以掌握T24細(xì)胞的生長特性和確定合理的細(xì)胞接種密度，然后分別用Hoechst染色

7、、流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測不同濃度PPS對T24細(xì)胞凋亡的影響。
　　研究PPS對T24細(xì)胞BCL-2基因表達(dá)的影響:用Western blotting和RT-PCR技術(shù)，分別檢測不同濃度PPS對T24細(xì)胞BCL-2蛋白和BCL-2 mRNA的影響。
　　研究PPS對T24細(xì)胞BCL-2 mRNA穩(wěn)定性的影響:用Actinomycin D阻抑轉(zhuǎn)錄，用RT-PCR測定各處理組細(xì)胞BCL-2 mRNA的相對表達(dá)量。分別以各組0h的m

8、RNA含量為100％，得到2、4、6h各時(shí)間點(diǎn)相對0h的mRNA剩余含量，檢測BCL-2mRNA的半衰期，以確定PPS對T24細(xì)胞BCL-2 mRNA穩(wěn)定性的影響。
　　研究PPS對HuR在T24細(xì)胞內(nèi)定位的影響:各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)不同濃度PPS處理24 h后，收集細(xì)胞，分段提取胞漿、胞核蛋白，Western blotting分析胞漿、胞核HuR蛋白的表達(dá)，以確定PPS對HuR在T24細(xì)胞內(nèi)定位的影響。
　　研究PPS對T24細(xì)

9、胞內(nèi)HuR-mRNA復(fù)合物中BCL-2 mRNA的含量:裂解細(xì)胞制備含mRNP的裂解液，預(yù)清除非特異性抗原，用抗體包被瓊脂糖徽球，免疫沉淀后進(jìn)行沉淀產(chǎn)物mRNA的純化和目的基因的PCR擴(kuò)增，以確定PPS對T24細(xì)胞內(nèi)BCL-2 mRNA與HuR結(jié)合的影響。
　　4、麥角甾醇通過HuR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)途徑調(diào)控T24細(xì)胞cyclin D1基因的表達(dá)
　　T24細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后分3組，實(shí)驗(yàn)分3組，對照組（正常培養(yǎng)的細(xì)胞，未做任何處理

10、）、0.5μM麥角甾醇組、1μM麥角甾醇組。分別用MTT染色、流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測麥角甾醇對T24細(xì)胞增殖的影響;用Western blotting和RT-PCR技術(shù)，分別檢測不同濃度麥角甾醇對T24細(xì)胞cyclin D1蛋白和cyclin D1mRNA的影響。
　　研究麥角甾醇對T24細(xì)胞cyclin D1 mRNA穩(wěn)定性的影響:用Actinomycin D阻抑轉(zhuǎn)錄，用RT-PCR測定各處理組細(xì)胞cyclin D1 mRNA的相

11、對表達(dá)量。分別以各組0h的mRNA含量為100％，得到2、4、6h各時(shí)間點(diǎn)相對0h的mRNA剩余含量，檢測cyclin D1 mRNA的半衰期，以確定麥角甾醇對T24細(xì)胞cyclin D1 mRNA穩(wěn)定性的影響。
　　研究麥角甾醇對HuR在T24細(xì)胞內(nèi)定位的影響:各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)不同濃度麥角甾醇處理48 h后，收集細(xì)胞，分段提取胞漿、胞核蛋白，Western blotting分析胞漿、胞核HuR蛋白的表達(dá)，以確定麥角甾醇對HuR在T