低氧通過(guò)SOCE的介導(dǎo)調(diào)節(jié)dHL-60細(xì)胞的極性化.pdf

1、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)的變化參與了細(xì)胞的很多生理病理性反應(yīng)，例如中性粒細(xì)胞的趨化和遷移就包括在內(nèi)。對(duì)于中性粒細(xì)胞外鈣內(nèi)流的調(diào)節(jié)機(jī)制和內(nèi)鈣離子濃度變化的研究已經(jīng)進(jìn)行了很多年，但是仍然存在爭(zhēng)論和分歧。現(xiàn)有的研究認(rèn)為，中性粒細(xì)胞的鈣內(nèi)流機(jī)制可能存在兩種形式：第一個(gè)是受體介導(dǎo)的鈣內(nèi)流機(jī)制，稱為受體操縱的鈣內(nèi)流(receptor-operated Ca2+entry，ROCE)；第二個(gè)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)清空所介導(dǎo)的鈣內(nèi)流機(jī)制，稱為鈣庫(kù)操縱的

2、鈣內(nèi)流(termed store-operated Ca2+entry，SOCE)。SOCE最早是在非興奮性細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，大量研究顯示SOCE參與了非興奮細(xì)胞的多種生理功能，并且是非興奮性細(xì)胞的主要鈣內(nèi)流的機(jī)制。目前，SOCE是鈣內(nèi)流研究的熱點(diǎn)之一，組成SOCE的主要兩個(gè)蛋白質(zhì)分子分別是：基質(zhì)相互作用分子(stromal interaction molecule1，STIM1)，它位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，是一種鈣感受器，可以感受鈣庫(kù)的內(nèi)鈣釋放和清

3、空，同時(shí)轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和細(xì)胞膜相連處，與細(xì)胞膜上的分子相互結(jié)合構(gòu)成一個(gè)鈣通道，引發(fā)鈣內(nèi)流；Orai1（又稱CRACM1），在細(xì)胞靜息狀態(tài)下，在細(xì)胞膜上散在分布，它響應(yīng)STIM1的招募，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，SITM1轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)膜上，同時(shí)Orai1收到號(hào)召，發(fā)生聚集，與STIM1的C末端結(jié)合，共同形成鈣通道。STIM1和Orai1的共表達(dá)是實(shí)現(xiàn)SOCE鈣內(nèi)流通道功能的基本組成。前期的大量研究證明了和SOCE特征相關(guān)的機(jī)制分子，為進(jìn)一步研

4、究SOCE在中性粒細(xì)胞功能中的作用，奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。有文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道非興奮性細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界各種刺激作出反應(yīng)時(shí)，SOCE參與其中，例如細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，包括細(xì)胞極性化和遷移，以及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在體和離體實(shí)驗(yàn)均證明細(xì)胞極性化和遷移通過(guò)SOCE介導(dǎo)的鈣信號(hào)調(diào)控，臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)分激活的SOCE導(dǎo)致中性粒細(xì)胞功能亢奮，最終引起炎癥反應(yīng)和組織損傷。由于細(xì)胞內(nèi)蛋白和細(xì)胞器的轉(zhuǎn)移定位，中性粒細(xì)胞在趨化物的存在下，細(xì)胞發(fā)生朝著趨化物發(fā)生定向的形態(tài)變化和趨化，這種

5、細(xì)胞功能依賴于細(xì)胞對(duì)趨化物濃度梯度的感受，通常前后極相差2％的趨化物濃度梯度就可以被細(xì)胞感受到，常見(jiàn)的趨化物有甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（N-formyl-Met-Leu-Pue，fMLP)、白細(xì)胞介素8(IL-8)、血小板激活因子(platelet-activating factor,PAF)、人白三烯(leukotriene B4，LTB4)、補(bǔ)體成分C5a(complement factor5a)等，這些趨化物都可以引起細(xì)胞發(fā)

6、生極性化和趨化反應(yīng)，屬fMLP（來(lái)源于細(xì)菌多肽）的刺激作用最強(qiáng)。趨化物多數(shù)作用于細(xì)胞膜上的G-蛋白偶聯(lián)受體，從而將胞外信號(hào)轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)信號(hào)，但不同的趨化物可能作用于不同的受體亞單位，從而作用于不同的蛋白，發(fā)生不同的效應(yīng)，因此在極性化和趨化上也存在著明顯的不同。由此可見(jiàn)，SOCE在中性粒細(xì)胞極性化、遷移以及呼吸爆發(fā)中扮演著重要的角色。
　　低氧導(dǎo)致組織多型核粒細(xì)胞的聚集，同時(shí)在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)質(zhì)作用，因?yàn)樗ㄟ^(guò)HIF-1α依賴性

7、的調(diào)節(jié)抑制中性粒細(xì)胞的凋亡。同時(shí)，中性粒細(xì)胞的極性化是細(xì)胞遷移的起始，并且是細(xì)菌感染時(shí)先天性免疫應(yīng)答的組成部分。盡管一些臨床和動(dòng)物研究表明低氧條件下中性粒細(xì)胞的殺菌、吞噬活性和傷口愈合受到影響，極少數(shù)的實(shí)驗(yàn)研究低氧對(duì)離體中性粒細(xì)胞功能的影響。Rotstein et al。發(fā)現(xiàn)在極端低氧的條件下（低于30mmHg），造成少數(shù)的但是顯著的趨化性遷移減少。McGovern et al.學(xué)者顯示低氧破壞人外周血中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生ROS的能力和殺S

8、taphylococcus aureusbut菌能力，但是低氧不影響他們的運(yùn)動(dòng)、遷移、受體調(diào)節(jié)和脫粒反應(yīng)。SOCE在細(xì)胞極性化中起重要作用，低氧條件下，中性粒細(xì)胞中SOCE的變化還未見(jiàn)報(bào)道，同時(shí)SOCE在中性粒細(xì)胞極性化中的作用未知。所以研究中性粒細(xì)胞的極性化和趨化功能的分子機(jī)制，對(duì)防治中性粒細(xì)胞功能異常導(dǎo)致的各種疾病及組織損傷具有重要意義。
　　目的：
　　通過(guò)低氧處理類中性粒細(xì)胞dHL-60（二甲亞砜（DMSO）誘導(dǎo)分化

9、成熟的類中性粒HL-60），以SOCE參與中性粒細(xì)胞極性化的調(diào)控機(jī)制作用作為切入點(diǎn)，觀察低氧條件下，趨化物fMLP刺激類中性粒細(xì)胞dHL-60細(xì)胞的極性化變化，并且研究SOCE基本組成成分（STIM1和Orai1）的變化以及細(xì)胞內(nèi)SOCE鈣濃度的變化，通過(guò)質(zhì)粒過(guò)表達(dá)SITM1和Orai1，分別觀察類中性粒細(xì)胞dHL-60細(xì)胞的極性化變化，找出SOCE在低氧下的類中性粒細(xì)胞極性化中的可能參與機(jī)制。
　　方法：
　　HL-60細(xì)

10、胞通過(guò)1.3%的DMSO誘導(dǎo)分化4-6天，期間不換液，得到類中性粒 dHL-60細(xì)胞用于本研究中的極性化實(shí)驗(yàn)和質(zhì)粒過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。觀察細(xì)胞的密度和活性。
　　1.實(shí)驗(yàn)分組：低氧處理組和常氧組細(xì)胞。常氧組：DMSO誘導(dǎo)分化4、5、6天的dHL-60細(xì)胞，分別命名為N4、N5、N6組。低氧組：DMSO誘導(dǎo)分化4天的dHL-60細(xì)胞，分別給以3%O2處理1、2天，分別命名為N4+H1、N4+H2組。
　　2.通過(guò)zigmond cha

11、mber小室建立趨化物fMLP濃度梯度為（0-100 nM），觀察低氧組細(xì)胞和常氧組對(duì)fMLP濃度梯度依賴性定向極性化變化。
　　3.通過(guò)Western blot方法，提取低氧組和常氧組細(xì)胞蛋白，電泳分析SOCE相關(guān)的兩個(gè)重要分子STIM1和Orai1在常氧和低氧下的表達(dá)，觀察低氧對(duì)STIM1和Orai1表達(dá)的影響。
　　4.運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)鈣離子測(cè)定的方法檢測(cè)低氧對(duì)TG刺激的鈣庫(kù)釋放和SOCE鈣內(nèi)流的影響。

12、
　　5.提取和純化質(zhì)粒(STIM1-mOrange、Orai1-mko和pcDNA3.1)，通過(guò)電穿孔實(shí)驗(yàn)，使STIM1和Orai1分子在低氧處理的中性粒細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，然后觀察質(zhì)粒過(guò)表達(dá)后，低氧組中性粒細(xì)胞對(duì)fMLP濃度梯度依賴性定向極性化變化。
　　6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS17.0軟件處理分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示。計(jì)量資料采用方差分析。計(jì)量數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且滿足方差齊性用One-way ANOVA方差分析，

13、組間兩兩比較采用LSD法；若方差不齊，采用welch檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Dunnett’s T3法。P<0.05認(rèn)為具有顯著性差異。
　　結(jié)果：
　　1.低氧2天組與正常6天組細(xì)胞相比，經(jīng)fMLP刺激的低氧2天組dHL-60細(xì)胞對(duì)fMLP濃度梯度依賴性的極性化反應(yīng)顯著增強(qiáng)。
　　2.正常5天組和正常6天組細(xì)胞相比，經(jīng)fMLP刺激的正常6天組dHL-60細(xì)胞對(duì)fMLP濃度梯度依賴性的極性化反應(yīng)減弱。
　　3.低氧

14、2天組與正常6天組細(xì)胞相比，低氧2天組dHL-60細(xì)胞中STIM1和Orai1的表達(dá)水平明顯降低。
　　4.正常5天組和正常6天組細(xì)胞相比，正常6天組dHL-60細(xì)胞中STIM1和Orai1的表達(dá)水平明顯升高。
　　5.低氧2天組與正常6天組細(xì)胞相比，低氧2天組dHL-60細(xì)胞內(nèi)SOCE的鈣內(nèi)流顯著降低。
　　6.正常5天組和正常6天組細(xì)胞相比，dHL-60細(xì)胞內(nèi)SOCE的鈣內(nèi)流沒(méi)有顯著性差異。
　　7.低氧2天

15、組與正常6天組細(xì)胞相比，低氧2天組dHL-60細(xì)胞TG引發(fā)的內(nèi)鈣釋放顯著降低。
　　8. STIM1質(zhì)粒過(guò)表達(dá)組與正常6天組以及pcDNA3.1質(zhì)粒組相比，STIM1質(zhì)粒過(guò)表達(dá)組STIM1分子的表達(dá)水平顯著高于其他兩組，STIM1-mOrange質(zhì)粒比Orai1-mKO更有效，和對(duì)照組pcDNA3.1質(zhì)粒比較表達(dá)水平分別提高了80%和20%。
　　9.低氧STIM1和Orai1質(zhì)粒過(guò)表達(dá)組細(xì)胞經(jīng)fMLP刺激對(duì)fMLP濃度梯度

16、依賴性的極性化反應(yīng)下降到正常對(duì)照組。
　　結(jié)論：
　　1．中性粒細(xì)胞的極性化通過(guò)鈣內(nèi)流的調(diào)節(jié)對(duì)于維持有效的宿主反應(yīng)是基本的。低氧主要影響中性粒細(xì)胞的凋亡，然而SOCE在低氧條件下中性粒細(xì)胞極性化中發(fā)揮的作用還不清楚。我們通過(guò)利用類中性粒細(xì)胞（人早幼粒白血病細(xì)胞株HL-60），檢測(cè)低氧（3%O2）對(duì)細(xì)胞極性化的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低氧會(huì)增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的極性化反應(yīng)。
　　2．低氧組dHL-60細(xì)胞內(nèi)STM1和Orai1均在低氧后

17、2天表現(xiàn)出明顯的下降，提示低氧對(duì)SOCE造成影響。
　　3．通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，我們用TG引發(fā)鈣庫(kù)的內(nèi)鈣釋放，通過(guò)加入外鈣，引起SOCE，結(jié)果顯示低氧2天組細(xì)胞SOCE有所下降，和Western blot結(jié)果一致，說(shuō)明低氧對(duì)dHL-60細(xì)胞SOCE產(chǎn)生了影響。
　　4．為了證明SOCE在低氧dHL-60細(xì)胞極性化中的作用，我們運(yùn)用質(zhì)粒過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)細(xì)胞電穿孔實(shí)驗(yàn)，將STIM1和Orai1分子在d