ZnPcS-,2-P-,2--PDT對su-DHL-4細(xì)胞的作用以及ZnPcS-,2-P-,2-在K562細(xì)胞、HL-60細(xì)胞、su-DHL-4細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位研究.pdf

1、惡性淋巴瘤是嚴(yán)重危害人民健康的常見血液系統(tǒng)惡性腫瘤。高劑量化療聯(lián)合自體骨髓移植是惡性淋巴瘤治療的一個有效手段，但自體骨髓移植物中殘留有惡性淋巴瘤細(xì)胞及白體骨髓缺乏移植物抗淋巴瘤效應(yīng)。因此，凈化骨髓移植物中的惡性淋巴瘤細(xì)胞對降低自體骨髓移植后惡性淋巴瘤的復(fù)發(fā)有重要意義。 光動力學(xué)療法(PDT)應(yīng)用于惡性淋巴瘤的體外凈化未見報道。znPcS<,2>P<,2>是一種金屬酞菁配合物，是我國合成的一種新型光敏劑。我們的前期研究表明了ZnP

2、cS<,2>P<,2>介導(dǎo)的PDT(ZnPcS<,2>P<,2>-PDT)可對K562細(xì)胞、HL-60細(xì)胞具有顯著的殺傷作用，對骨髓移植物中摻入的白血病細(xì)胞有較好的凈化作用。但ZnPcS<,2>P<,2>-PDT是否對惡性淋巴瘤細(xì)胞也有作用則未見報道。本實驗以濾泡性淋巴瘤細(xì)胞株su-DHL-4細(xì)胞為模型，研究ZnPcS<,2>P<,2>-PDT對該細(xì)胞的殺傷作用及其機(jī)制，從而為以后ZnPcS<,2>P<,2>-PDT應(yīng)用于惡性淋巴瘤自體

3、骨髓移植物的體外凈外奠定實驗基礎(chǔ)。 PDT治療腫瘤的基本原理：光敏劑在接受特定波長的光能后，通過光化學(xué)反應(yīng)和能量傳遞過程，將光能轉(zhuǎn)化為分子內(nèi)能。在有氧條件下，可產(chǎn)生多種活性氧物質(zhì)，使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能受到嚴(yán)重影響，從而干擾腫瘤細(xì)胞的生長并導(dǎo)致其死亡?；钚匝醭煞謮勖鼧O短，只對幾十納米范圍的生物大分子起作用。而細(xì)胞直徑在微米數(shù)量級。所以研究光敏劑的作用靶點，既光敏劑在細(xì)胞中定位的對揭示光動力學(xué)療法的機(jī)制有重要意義。激光共聚焦顯微鏡(1

4、aser scanning confocalmicroscope，LSCM)是在熒光成像基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，利用計算機(jī)進(jìn)行圖像處理，使用不同波長的激光激發(fā)熒光探針，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像。利用激光共聚焦顯微鏡和特異的細(xì)胞器探針可以得到ZnPcS2P2在細(xì)胞中的精確定位，明確其在細(xì)胞中作用靶點。本文的研究內(nèi)容主要包括： 一、ZnPcS<,2>P<,2>-PDT對su-DHL-4細(xì)胞增殖的作用 調(diào)整細(xì)胞

5、濃度為5×10<'6>/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200μL細(xì)胞懸液，分別加入終濃度為0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 μg/ml的ZnPcS<,2>P<,2>,孵育5h后光照；同時設(shè)立溶劑對照組、光對照組、含2.0 μg/ml ZnPcS<,2>P<,2>的光敏劑對照組。光照條件：用670nm激光以53mW/cm<'2>的功率密度、2.1J/cm<'2>的能量密度照射。將處理后的細(xì)胞濃度調(diào)整為2.0×10<,5>/ml

6、接種于96孔板，孵育48h后，MTT比色法檢測ZnPcS<,2>P<,2>-PDT對su-DHL-4細(xì)胞增殖的影響。 二、ZnPcS<,2>P<,2>-PDT對su-DHL-4細(xì)胞凋亡的作用 0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml的．ZnPcS<,2>P<,2>與su-DHL-4細(xì)胞孵育5h后，光照條件同上。同時設(shè)立溶劑對照組、光對照組、相應(yīng)濃度的ZnPcS<,2>P<,2>對照組。取光照后24h細(xì)胞，應(yīng)

7、用TUNEL、AO/EB復(fù)合染色等手段來檢測凋亡。 三、ZnPcS<,2>P<,2>在K562細(xì)胞、HL-60細(xì)胞、su-DHL-4細(xì)胞中定位研究 K562細(xì)胞、HL-60細(xì)胞、su-DHL-4細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，5 x 10<'6>/ml細(xì)胞與lug/ml的ZnPcS<,2>P<,2>孵育5h。與ZnPcS<,2>P<,2>共孵育的細(xì)胞在完全避光條件分別與線粒體探針Rhodamine123、溶酶體探針Lys

8、oTracker DND-26、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)探針DIOC6(3)共孵育。前二種探針與細(xì)胞共同孵育時間為30 min，后者與細(xì)胞共孵育時間為1min，PBS洗3次。各個實驗組在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察的細(xì)胞器探針熒光圖像與．ZnPcS<,2>P<,2>熒光圖像分別顯示為綠色與紅色的偽彩色輸出。利用直接觀察法、偽彩色融合法、波行比較法、相關(guān)系數(shù)法來分析二者之間的相互關(guān)系。 取得如下結(jié)果： 1、不同濃度ZnPcS<,2>P<,2>

9、-PDT組對su-DHL-4細(xì)胞均有殺傷作用，與對照組相比均有顯著性差別(p<0.01)，并呈ZnPcS<,2>P<,2>劑量相關(guān)。達(dá)到半數(shù)抑制率時的劑量(IC<,50>值)為0.41μg/ml。 2、ZnPcS<,2>P<,2>-PDT后24小時，TUNEL顯示處理組的su-DHL-4細(xì)胞可發(fā)生凋亡。0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml組的ZnPcS<,2>P<,2>-PDT的su-DHL-4細(xì)胞凋亡率分別為

10、4.4％、13.9％、 23.6％。AO/EB復(fù)合染色可見處理組的su-DHL-4細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)濃縮聚集或成碎片，呈現(xiàn)凋亡表象。上述結(jié)果提示ZnPcS<,2>P<,2>-PDT可誘導(dǎo)su-DHL-4細(xì)胞凋亡。 3、利用熒光探針的細(xì)胞器特異性分布確定ZnPcS<,2>P<,2>在細(xì)胞器中的位置，通過直接觀察法、偽彩色融合法、波行比較法、相關(guān)系數(shù)法表明ZnPcS<,2>P<,2>定位于K562細(xì)胞、HL-60細(xì)胞、su-DHL-4細(xì)胞中的線