肺泡化阻滯的新機(jī)制：LPS通過(guò)抑制CSK活性影響肌成纖維細(xì)胞的極性.pdf

1、目的：支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是早產(chǎn)兒中最常見的慢性肺部疾病。在胎齡小于30周的早產(chǎn)兒中發(fā)病率可達(dá)到20％-30%，而重癥患兒的死亡率可達(dá)30%-40%。BPD是導(dǎo)致早產(chǎn)兒患病和死亡的常見病因，同時(shí)也是嬰兒期慢性呼吸系統(tǒng)疾病和神經(jīng)發(fā)育落后的重要病因。近年來(lái)隨著早產(chǎn)兒重癥監(jiān)護(hù)技術(shù)的提高，提出了“新型BPD”的概念，其主要病理表現(xiàn)為：次級(jí)分隔縮短、肺泡數(shù)目減少、體積增大及結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單化等。

2、流行病學(xué)資料顯示，胎兒的未成熟肺暴露于宮內(nèi)炎性環(huán)境中，是早產(chǎn)兒出生后發(fā)生BPD的重要危險(xiǎn)因素。羊膜腔注射LPS造成新生鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單化，是模擬BPD病理改變的經(jīng)典模型。我們通過(guò)建立新生鼠動(dòng)物模型，來(lái)探討LPS導(dǎo)致新生鼠肺泡化阻滯病理改變的分子機(jī)制，同時(shí)探索茶堿對(duì)LPS導(dǎo)致新生鼠肺泡化阻滯病理過(guò)程能否起到保護(hù)作用。
　　方法：第一部分：選擇孕16.5天的SD大鼠羊膜腔注射LPS或等體積生理鹽水，待其自然分娩。實(shí)驗(yàn)分為L(zhǎng)PS組和

3、生理鹽水（saline）組。取第七天新生鼠左上肺組織做HE染色病理切片并進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。各組隨機(jī)選取4個(gè)右肺組織融合，各做一張細(xì)胞因子抗體芯片；第二部分：抗體芯片結(jié)果提示LPS上調(diào)了一系列細(xì)胞遷移相關(guān)因子和蛋白，而CSK參與這些因子與蛋白的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并且是細(xì)胞骨架的重要調(diào)控蛋白。本部分實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫熒光染色觀察LPS對(duì)新生鼠肺組織肌成纖維細(xì)胞遷移和定位的影響及高爾基體極性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LPS對(duì)肌成纖維細(xì)胞遷移極性的影響。同時(shí)測(cè)定LPS對(duì)第七天

4、新生鼠右肺組織和體外培養(yǎng)的肌成纖維細(xì)胞csk蛋白的表達(dá)水平及csk的蛋白激酶活性的影響。并進(jìn)一步用csk抑制劑PP1作用于肌成纖維細(xì)胞，通過(guò)高爾基體極性實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)csk活性對(duì)其定向遷移的影響；第三部分：選擇孕16.5天的SD大鼠羊膜腔注射LPS，待其自然分娩。新生鼠生后6小時(shí)內(nèi)于頸部皮下注射生理劑量的茶堿或等體積生理鹽水，每天一次，連續(xù)七天。實(shí)驗(yàn)分為L(zhǎng)PS組，LPS+茶堿（theo）組。取第七天新生鼠左上肺組織做HE染色病理切片并進(jìn)行形態(tài)

5、學(xué)分析，各組隨機(jī)選取4個(gè)右肺組織融合，各做一張細(xì)胞因子抗體芯片。
　　結(jié)果：（1）HE染色結(jié)果顯示：LPS組較生理鹽水（saline）組肺泡數(shù)量減少，次級(jí)突起數(shù)量減少(41±8.5 VS75±7.3;13±4.8 VS26±5.9，P<0.05)。抗體芯片結(jié)果顯示，LPS組較生理鹽水（saline）組上調(diào)的細(xì)胞因子中，炎癥細(xì)胞因子IL-1α，IL-1β，IL-6、IL-12及IL-13明顯上調(diào)，分別上調(diào)了2.6倍、44.5倍、3.

6、6倍、4.4倍、3.6倍；（2）抗體芯片提示LPS組較生理鹽水（saline）組的細(xì)胞遷移相關(guān)因子及蛋白b-FGF，CXCR4及EGFR明顯上調(diào)，分別上調(diào)了7.0倍、13.2倍、8.0倍，而MMP-2，MMP-13，MMP-8分別下調(diào)22.4倍,21.3倍,18.9倍。新生鼠肺組織免疫熒光染色結(jié)果顯示，LPS組較生理鹽水（saline）組，肌成纖維細(xì)胞主要聚集在初級(jí)突起，而遷移至次級(jí)突起的數(shù)量明顯減少。在生后的1、3、7、14天，對(duì)照組

7、中分布在次級(jí)突起的肌成纖維細(xì)胞相對(duì)數(shù)量迅速增加并逐漸超過(guò)定位于初級(jí)突起的肌成纖維細(xì)胞數(shù)，而在LPS組這種趨勢(shì)相對(duì)緩慢。高爾基體極性實(shí)驗(yàn)顯示，向劃痕方向定向遷移細(xì)胞數(shù)比例 LPS組明顯少于對(duì)照組（0.41±0.03 VS0.61±0.03），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。LPS上調(diào)的細(xì)胞遷移相關(guān)因子與蛋白的下游調(diào)控蛋白 CSK在新生鼠肺組織及人胚肺肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平無(wú)明顯差異，但在肺組織中csk的蛋白激酶活性降低。高爾基體極性實(shí)

8、驗(yàn)表明，CSK的抑制劑PP1誘導(dǎo)后，向劃痕方向定向遷移細(xì)胞數(shù)比例較對(duì)照組明顯減少（0.412±0.155 VS0.637±0.160），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；（3）HE染色結(jié)果顯示：LPS+茶堿（theo）組較LPS組肺泡數(shù)量及次級(jí)突起數(shù)量增加(65±6.7 VS42±8.2;20±5.6 VS13±5.1，P<0.05)。LPS+theo組炎癥因子TNF-α、MIP-1α及MIP-2的表達(dá)較LPS組明顯降低，分別降低37.

9、4倍、12.5倍、8.6倍。抗炎癥因子TGF-β家族成員TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3的表達(dá)明顯增加，分別增加2.4倍、56.9倍、17.8倍。
　　結(jié)論：羊膜腔注射LPS誘導(dǎo)的BPD病理模型中,新生鼠肺組織中促炎癥因子表達(dá)水平升高以及一系列遷移相關(guān)因子和蛋白的表達(dá)水平的改變，為BPD的發(fā)病機(jī)制研究提供線索; LPS可能通過(guò)抑制CSK的活性，進(jìn)而抑制肌成纖維細(xì)胞的極性，導(dǎo)致其定向遷移受阻,引起肺泡化阻滯；茶堿能夠調(diào)節(jié)炎癥