大鼠腦內(nèi)β淀粉樣蛋白沉積引起的外周血T細(xì)胞應(yīng)答.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是年齡相關(guān)的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量。因此，研究AD的發(fā)病機(jī)制，探索防治AD的干預(yù)靶點(diǎn)，是神經(jīng)科學(xué)的工作重點(diǎn)。AD動(dòng)物模型是研究工作的重要工具。 在對(duì)AD發(fā)病因素的研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)p淀粉樣蛋白(beta—amyloidprotein，Aβ)在腦內(nèi)的沉積是AD發(fā)病的早期過(guò)程和中心環(huán)節(jié)。聚集態(tài)的Aβ發(fā)揮神經(jīng)毒性，啟動(dòng)了AD的病理進(jìn)程，包括膠質(zhì)的廣泛活

2、化、炎性微環(huán)境產(chǎn)生、神經(jīng)元功能紊亂及死亡等。 Aβ的沉積活化腦內(nèi)具有吞噬活性的小膠質(zhì)細(xì)胞，引起先天性免疫應(yīng)答(innate immune response)。Ap能否募集外周血免疫細(xì)胞穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦向炎癥部位聚集，引起過(guò)繼性免疫應(yīng)答(adaptive immune response)尚不清楚。血腦屏障由微血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜和星型膠質(zhì)細(xì)胞的足突構(gòu)成，將腦實(shí)質(zhì)和血液分開(kāi)，正常情況下免疫系統(tǒng)的細(xì)胞和分子不能自由進(jìn)入腦。但是，隨著

3、研究不斷進(jìn)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到，即使在生理狀態(tài)下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)也存在免疫監(jiān)視過(guò)程。外周淋巴細(xì)胞可以主動(dòng)進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，啟動(dòng)腦內(nèi)的免疫應(yīng)答，清除可能會(huì)引起腦病變的因子。 。 淋巴細(xì)胞穿過(guò)血腦屏障是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。淋巴細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的黏附分子及其受體的相互作用發(fā)揮了重要作用。本研究室陳譽(yù)華課題組在研究AD病人T細(xì)胞穿過(guò)血腦屏障機(jī)制的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)AD病人外周血T淋巴細(xì)胞穿過(guò)血腦屏障體外模型——人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞單層的能

4、力顯著增高；并且證實(shí)AD病人外周血T淋巴細(xì)胞高表達(dá)巨嗜細(xì)胞炎癥蛋白－1α(macrophage inflammatory protein－1α，MIP－1α)；MIP－1α通過(guò)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞骨架而引起內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接開(kāi)放?；诖?，本研究采用立體定向注射的方法，建立Aβ在腦內(nèi)沉積的動(dòng)物模型，旨在研究外周血T細(xì)胞所表達(dá)的MIP-1a是否為T(mén)細(xì)胞穿過(guò)血腦屏障的決定因子，同時(shí)分析人腦的T細(xì)胞在AD病變中的可能作用。 1、建立腦內(nèi)沉積A

5、β的動(dòng)物模型 制備聚集態(tài)Aβ<,1-42>和Aβ<,42-1>，通過(guò)立體定位技術(shù)將Aβ<,1-42>注射到Wist-ar大鼠雙側(cè)海馬，對(duì)照組注射等體積的Aβ<,42-1>和PBS。 2、標(biāo)本采集與處理 分別于海馬注射后3天、7天和14天，從大鼠心臟采血，肝素抗凝。然后經(jīng)左心室依次灌注生理鹽水和4％多聚甲醛，立即取腦。制備冰凍切片時(shí)，腦組織經(jīng)后固定和蔗糖溶液浸泡，冰凍切片機(jī)上行冠狀切片，片厚10um，隔lO取l，連

6、續(xù)取10張切片。制備石蠟切片時(shí)，腦組織經(jīng)后固定和常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟，石蠟切片機(jī)上行冠狀切片，片厚5um，隔10取1，連續(xù)取10張切片。 3、實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)外周血T細(xì)胞中MIP-1僅和CCR5 mRNA的表達(dá)水平 構(gòu)建用于實(shí)時(shí)定量PCR分析的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒pUCmT-MIP-1a、pUCmT-CCR5和pUCmT-GAPDH：利用單個(gè)核細(xì)胞分離液和MagCellect RatCD3<'+>T Cell Is

7、olation試劑盒，分離外周血T細(xì)胞。通過(guò)Trizol試劑提取T細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)MIP-1a、CCR5和GAPDH的基因序列，按定量PCR檢測(cè)的要求設(shè)計(jì)引物和Taqman探針。利用PCR技術(shù)從T細(xì)胞擴(kuò)增MIP-1a、CCR5和GAPDH基因片段。通過(guò)T-A克隆將MIP—la、CCR5和GAPDH基因片段連接到pUCmT載體上，命名為pUCmT-MIP-lA、pUCmT-CCR5和pUCmT-GAPDH。將重組質(zhì)粒

8、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5a，通過(guò)藍(lán)白篩選，酶切鑒定，驗(yàn)證插入片段的存在。將重組質(zhì)粒送交測(cè)序，驗(yàn)證插入片段序列的正確性。 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)MIP-1a和CCR5：采用相對(duì)定量法。以GAPDH作為歸一化MIP-1a、CCR5的持家基因。以構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA為標(biāo)準(zhǔn)品，以質(zhì)粒初始模板絕對(duì)量的對(duì)數(shù)作橫坐標(biāo)、Ct值作縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以“目的基因初始模板量/GAPDH初始模板量”比值代表每個(gè)標(biāo)本目的基因的mRNA表達(dá)水平的相對(duì)量。4、觀

9、察Aβ<,1-42>沉積對(duì)T細(xì)胞穿過(guò)血腦屏障的影響 利用Aβ<,1-42>的抗體，通過(guò)免疫熒光技術(shù)觀察Aβ<,1-42>在腦內(nèi)的沉積。利 用vWF和CCR5的抗體，通過(guò)雙免疫熒光技術(shù)觀察Aβ<,1-42>沉積對(duì)腦微血管 內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MIP-lα的受體CCR5的影響。利用CD3的抗體，通過(guò)免疫 熒光技術(shù)觀察Aβ<,1-42>沉積對(duì)T細(xì)胞穿過(guò)血腦屏障的影響。利用CD4和 CD8的抗體，通過(guò)免疫熒光技術(shù)分析穿過(guò)血腦屏障的T細(xì)胞

10、的亞型。大鼠 腹腔注射MIP-lα的中和抗體，觀察阻斷MIP-1α的效應(yīng)對(duì)T細(xì)胞穿過(guò)血 腦屏障的影響。 5、觀察干預(yù)T細(xì)胞人腦對(duì)Aβ<,1-42>沉積所引起的小膠質(zhì)細(xì)胞活化和神經(jīng) 細(xì)胞凋亡的影響。 利用CDl1b的抗體，通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察Aβ活化的小膠質(zhì)細(xì) 胞吞噬沉積的Aβ<,1-42>。利用活化caspase一3的抗體，通過(guò)免疫熒光技術(shù)觀 察海馬內(nèi)注射Aβ<,1-42>后腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的情況。通過(guò)尼氏

11、染色觀察 Aβ<,1-42>沉積引起的神經(jīng)元損傷。大鼠腹腔注射MIP-1α的中和抗體，觀察 阻斷MIP-1α的效應(yīng)對(duì)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞增生、活化和神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。 6、觀察海馬內(nèi)注射Aβ<,1-42>對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖和分化的影響 利用Brdu能摻入細(xì)胞周期的S期，標(biāo)記增殖細(xì)胞的特性，將Brdu注射 人大鼠腹腔。利用Brdu的抗體，通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察海馬內(nèi)注射 Aβ<,1-42>對(duì)細(xì)胞增殖的影響。利用DCX的

12、抗體，通過(guò)免疫熒光技術(shù)觀察海馬 內(nèi)注射Aβ<,1-42>對(duì)產(chǎn)生未成熟神經(jīng)元的影響。利用Brdu和DCX的抗體，通過(guò)雙免疫熒光技術(shù)觀察海馬內(nèi)注射Aβ<,1-42>后增殖細(xì)胞的表型。 1、成功制備了Aβ在腦內(nèi)沉積的動(dòng)物模型。 2、腦內(nèi)Aβ<,1-42>沉積誘導(dǎo)外周血T細(xì)胞過(guò)表達(dá)MIP-lα，促進(jìn)T細(xì)胞穿過(guò)血腦屏障入腦 腦內(nèi)Aβ<,1-42>沉積引起大量外周血T細(xì)胞穿過(guò)血腦屏障遷移入腦，與對(duì)照組比，數(shù)量顯著增加(P<

13、0.01)，主要分布在大腦皮質(zhì)和海馬，CD4<'+>T細(xì)胞和CD8<'+>T細(xì)胞都可被觀察到。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)Aβ<,1-42>沉積誘導(dǎo)外周血T細(xì)胞過(guò)表達(dá)MIP-1α，與對(duì)照組比，顯著增高(P<0.01)；但不上調(diào)其受體CCR5在T細(xì)胞中的表達(dá)(P>0.05)。Aβ<,1-42>沉積還上調(diào)了腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上CCR5的表達(dá)。大鼠腹腔注射MIP-1α的中和抗體，阻斷MtP-1α的效應(yīng)后，外周血T細(xì)胞進(jìn)入腦內(nèi)的數(shù)量明顯減少，與注射同型I

14、gG的對(duì)照組比，差異顯著(P<0.01)。 3、阻斷T細(xì)胞入腦抑制了腦內(nèi)Aβ<,1-42>沉積引起的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化 Aβ<,1-42>沉積引起CDllb陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增加并活化，與對(duì)照組比，差異顯著(P<0.01)，表現(xiàn)為由靜止的分枝狀轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨陌⒚装蜖?；主要組織相容性復(fù)合物(Major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ類(lèi)分子陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量也比對(duì)照組顯著增加(P<0.01)。

15、并且MHCⅡ類(lèi)分子陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞向沉積的AB。一心遷移并加以吞噬。大鼠海馬內(nèi)注射Aβ<,1-42>還引起了神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量比對(duì)照組顯著增多(P<0.01)。大鼠腹腔注射MIP-1α的中和抗體阻斷T細(xì)胞入腦抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞增生和活化，但未能抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。 4、大鼠海馬內(nèi)注射Aβ<,1-42>增強(qiáng)了神經(jīng)前體細(xì)胞增殖和分化能力 Aβ<,1-42>沉積引起海馬齒狀回顆粒下層(subgranular zone，SGZ)和側(cè)腦室

16、下層(subventricular zone，SVZ)Brdu標(biāo)記細(xì)胞比對(duì)照組顯著增多(P<0.01)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)SGZ和SVZ區(qū)DCX陽(yáng)性細(xì)胞也比對(duì)照組顯著增多(P<0.01)。雙免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)Brdu標(biāo)記的增殖細(xì)胞多為新生神經(jīng)元。 1．大鼠腦內(nèi)Aβ沉積能特異性地誘導(dǎo)外周血T細(xì)胞高表達(dá)MIP-1α，并上調(diào)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞上CCR5的表達(dá)。 2．T細(xì)胞表達(dá)的MIP-1α與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的CCR5的相互作用可能參與到