脆性X綜合征分子診斷方法體系的建立及其疾病基因新型可變剪接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的鑒定.pdf

1、脆性X綜合征(fragile X syndrome，F(xiàn)XS)是一種常見的遺傳性智力障礙疾病。1991年在Xq27.3處克隆了該病的疾病基因——脆性X智力障礙1基因(fragile X mental retardation1 gene，F(xiàn)MR1)。FMR1基因跨越38Kb，由17個(gè)外顯子和16個(gè)內(nèi)含子組成，編碼一功能未明的RNA結(jié)合蛋白。已證實(shí)FMR1基因存在多種可變剪接方式，主要涉及四個(gè)外顯子，并且在不同組織中其剪接形式并非一致，但其具

2、體的功能仍未明確。同時(shí)，F(xiàn)XS發(fā)病率高、臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣、并存在傳遞擴(kuò)展的遺傳特性，因此，建立完善的實(shí)驗(yàn)室診斷方法尤為重要。 本研究依據(jù)FMR1基因突變的特點(diǎn)，分別從基因組DNA和mRNA兩條途徑建立FXS分子診斷方法。采用甲基化特異性PCR，從基因組DNA途徑檢測(cè)FMR1基因5’端非翻譯區(qū)CGG重復(fù)情況和CpG島甲基化狀態(tài)；采用長(zhǎng)鏈RT-PCR技術(shù)，以cDNA為模板，擴(kuò)增FMR1基因編碼區(qū)全長(zhǎng)序列，再分4個(gè)片段進(jìn)行二次PCR，

3、并對(duì)PCR產(chǎn)物直接測(cè)序。利用上述方法對(duì)一疑似FXS患者及其家系成員進(jìn)行了檢測(cè)。 同時(shí)，本研究利用克隆-測(cè)序技術(shù)，從RNA水平對(duì)該患者外周血FMR1基因的可變剪接產(chǎn)物進(jìn)行分析。利用長(zhǎng)鏈RT-PCR擴(kuò)增FMR1基因編碼序列，并將其插入T克隆載體進(jìn)行序列測(cè)定，進(jìn)一步分析剪接異構(gòu)體表達(dá)情況。結(jié)果顯示：在所檢測(cè)的19個(gè)克隆中存在11種剪接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其中發(fā)現(xiàn)6個(gè)涉及FMR1基因內(nèi)含子9部分片段的插入的剪接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(6/19)。針對(duì)新發(fā)現(xiàn)的F

4、MR1基因內(nèi)含子9部分片段的插入的剪接方式，本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)FMR1基因內(nèi)含子9序列進(jìn)行剪接信號(hào)相關(guān)分析，證明該內(nèi)含子插入片段可能為一個(gè)隱秘外顯子(cryptic exon)。同時(shí)，分析結(jié)果顯示，該隱秘外顯子的出現(xiàn)，提前引入終止密碼子，可能通過(guò)NMD途徑導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物降解，使功能性FMRP減少。 本研究還利用克隆-測(cè)序技術(shù)，以四個(gè)正常人外周血樣本和一份腦組織cDNA文庫(kù)為模板，進(jìn)一步分析了FMR1基因剪接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達(dá)情況