年齡相關性冠心病病人骨髓間充質干細胞體外培養(yǎng)及低能量激光干預對細胞增殖能力影響的研究.pdf

1、目的：骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有易于在體外擴增、多種分化潛能、低免疫性等特性，臨床應用前景廣泛，但其需在體外應用含胎牛血清等培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，可能導致細胞生物學特性發(fā)生改變以及其它潛在風險，從而限制了臨床批文的下發(fā)，故臨床試驗細胞來源多限于骨髓單個核細胞（morionuclear bone marrow cells，BMC），循環(huán)血前體細胞（circulating blood-deriv

2、ed progenitor cells，CPC）及骨骼肌原細胞（skeletal myoblasts），有關冠心病病人骨髓MSCs基礎研究鮮見報道。本研究旨在探索適于冠心病病人骨髓MSCs骨髓提取、細胞分離、培養(yǎng)的方法，并比較中老年冠心病病人骨髓MSCs增殖能力差異；探索冠心病病人骨髓MSCs凍存復蘇可能性及對細胞生長特性的影響；應用低能量激光對細胞培養(yǎng)過程進行干預，了解其對細胞增殖能力的影響。
　　 方法：冠心病，三支血管病變

3、，行CABG手術病人，中年組23例（年齡45～59歲，平均53±5歲）、老年組26例（年齡>60歲，平均65±4歲），正中開胸，劈開胸骨前抽取10ml胸骨骨髓，用Ficoll液密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞，進行貼壁培養(yǎng)，適時傳代，記錄原傳時間、首次傳代時間、平均傳代時間；取中年組、老年組各10例冠心病病人骨髓MSCs P1代細胞接種于96孔板，于接種后第2、4、……14天用MTT法490nm波長處測定吸光度，繪制細胞增殖曲線；取生長

4、旺盛之骨髓MSCs進行凍存，中老年組各3例，3-4個月后進行復蘇，觀察細胞生長與傳代情況；老年組6例骨髓MSCs P2代細胞，接種于96孔板，接種24小時細胞完全貼壁后應用低能量激光（0.5，2.0 J/c㎡）對細胞進行照射（Low-Level Lager Irradiation，LLLI），于接種后第2、4、……10天用MTI法測定細胞增殖曲線。
　　 結果：3例老年冠心病病人無明顯骨髓液抽出，劈開胸骨后發(fā)現(xiàn)骨質疏松明顯，骨髓

5、腔呈空洞樣改變；23例中年冠心病病人及23例老年冠心病病人骨髓液經(jīng)Ficoll液分離離心能獲得107數(shù)量級單個核細胞。貼壁培養(yǎng)后骨髓MSCs呈梭型生長，并能進行傳代，最多傳代超過15代，培養(yǎng)時間超過92天。隨著年齡增加，老年組原傳時間、傳P1時間、P1-P6平均傳代時間均延長（P<0.05）。培養(yǎng)過程中，未能達到原傳，以及傳代過程中失去傳代能力情況隨著年齡增加以及傳代次數(shù)增加而增加，雖P>0.05，但老年組更為明顯；增殖曲線顯示，從第4

6、、6天開始細胞增殖加速，與中年組的骨髓MSCs增殖曲線相比，老年組的骨髓MSCs增殖較中年組減慢，第1 2、1 4天P<0.05，有統(tǒng)計學意義（n=10）。凍存細胞復蘇后仍能進行生長傳代，細胞形態(tài)及傳代能力與凍存前無明顯變化。接受低能量激光照射后，骨髓MSCs增殖曲線顯示，第4、6、8、10天0.5J/c㎡及2J/c㎡能量組細胞增殖均顯著快于對照組，P<0.05（n=6），但兩照射組之間無顯著性差異，P>0.05。
　　 結論：

7、本研究證實了從冠心病人的胸骨分離培養(yǎng)骨髓MSCs的方法是可行的，但骨髓MSCs的增殖能力隨年齡及傳代次數(shù)的增加而逐漸降低，因此，細胞移植應選擇適宜的細胞代數(shù)，并需通過增加骨髓抽取量或采取更合適的培養(yǎng)方法，以期獲得生長旺盛并且足夠數(shù)量的移植細胞。骨髓MSCs凍存技術確實可行，有望提前為病人準備足夠數(shù)量生長旺盛的細胞，可為高齡冠心病病人細胞移植提前準備好骨髓MSCs，甚至提供自體年輕的骨髓MSCs。低能量激光干預能促進MSCs增殖，提示可以