DNA損傷修復相關基因CSB-PGBD3、MSH5和FMR1在卵巢早衰發(fā)病中的作用機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 中國漢族卵巢早衰家系的全外顯子組測序研究
　　目的:目前卵巢早衰的遺傳學研究主要依賴于模式動物及散發(fā)性POF病例的基因突變篩查，但進展緩慢?；蚪M學技術的發(fā)展為尋找疾病易感位點和候選基因提供了更高效精準的手段，因此，本研究擬通過高覆蓋率的全外顯子組測序技術，以POF家系為研究對象，希望發(fā)現(xiàn)新的POF致病基因。
　　方法:在中國漢族非近親婚配家系POF-1中分別選取POF患

2、者、致病基因疑似攜帶者和非攜帶者，使用illumina測序平臺進行全外顯子組測序，所獲結果與hg19數(shù)據庫進行序列對比，并按照常染色體顯性遺傳方式進行候選基因篩選，然后在其他成員中通過Sanger測序進行驗證，并在432例散發(fā)性POF患者和400例正常對照中進行候選基因突變篩查。
　　結果:在POF-1家系的全外顯子組測序中，我們發(fā)現(xiàn)了符合常染色體顯性遺傳規(guī)律的錯義突變PGBD3c.2237G＞A(p.G746D)。由于轉座子基因

3、PGBD3能夠插入CSB基因形成CSB-PGBD3融合基因，因此我們在432例散發(fā)性POF患者和400例正常對照中對CSB-PGBD3進行了基因突變篩查，繼而又發(fā)現(xiàn)了雜合錯義突變c.3166G＞A(p.V1056I)和雜合無義突變c.643G＞T(p.E215X)。
　　結論:首次發(fā)現(xiàn)CSB-PGBD3基因突變與家族性和散發(fā)性POF密切相關，為POF致病機制研究提供了新的方向。高通量的全外顯子組測序技術也為POF的遺傳學研究提供了

4、有力的技術支持。
　　第二部分 CSB-PGBD3基因突變對DNA損傷修復功能的影響
　　目的:通過對POF-1家系進行全外顯子組測序研究，我們發(fā)現(xiàn)了POF候選致病基因CSB-PGBD3。PGBD3是靈長類動物特有的轉座子基因，它可以插入CSB基因形成CSB-PGBD3融合基因，并表達CSB-PGBD3融合蛋白。有學者發(fā)現(xiàn)CSB-PGBD3融合蛋白參與DNA損傷的轉錄耦聯(lián)修復，但該基因在生殖細胞中的作用及其對卵巢功能的影響尚

5、無報道。本課題擬通過研究CSB-PGBD3融合蛋白在卵巢組織中的表達情況及突變對其DNA損傷修復功能的影響，探討CSB-PGBD3與卵巢早衰的關系及致病機制。
　　方法:利用人和恒河猴的卵巢組織對PGBD3和CSB-PGBD3融合蛋白進行卵巢組織定位。通過clonogenic survival實驗檢測CSB-PGBD3基因突變對細胞存活的影響。通過laser irradiation和H2O2損傷實驗明確CSB-PGBD3的DNA損

6、傷修復功能。通過對比野生型和突變型CSB-PGBD3與RNAPolⅡ等DNA損傷修復因子的相互作用，探討CSB-PGBD3參與DNA損傷修復的具體機制及突變對其功能的影響。
　　結果:通過在卵巢組織中的定位研究，我們發(fā)現(xiàn)PGBD3和CSB-PGBD3融合蛋白在靈長類動物各級卵泡的卵母細胞核中特異性表達。通過多種DNA損傷修復實驗，我們發(fā)現(xiàn)CSB-PGBD3能夠通過與RNApolⅡ結合，參與DNA損傷的轉錄耦聯(lián)修復機制。此外，CSB

7、-PGBD3能夠上調XPA、DDB1等DNA損傷修復因子的表達，促進更廣泛的DNA修復。我們所發(fā)現(xiàn)的3種突變均不同程度地影響了CSB-PGBD3的DNA損傷修復功能。
　　結論:CSB-PGBD3融合蛋白是卵母細胞重要的DNA損傷修復因子，CSB-PGBD3基因突變導致的卵母細胞DNA損傷修復功能障礙可能是POF的致病機制之一。
　　第三部分 DNA損傷修復因子MSH5在卵巢早衰發(fā)病中的作用機制研究
　　目的:MSH5

8、是重要的減數(shù)分裂相關基因，促進同源重組過程中HollidayJunction的形成和穩(wěn)定，對第一次減數(shù)分裂前期聯(lián)會復合體的形成和配子發(fā)生具有重要作用。本研究的目的是探討MSH5基因突變與卵巢早衰的相關性及其致病機制。
　　方法:通過對中國漢族非近親婚配家系POF-2進行全外顯子組測序，并在432例散發(fā)性POF患者中進行驗證，我們發(fā)現(xiàn)了MSH5基因突變。利用RT-PCR和免疫組化在人和恒河猴的卵巢組織中進行MSH5表達定位;通過cl

9、onogenicsurvival實驗檢測野生型和突變型MSH5蛋白對細胞存活的影響;利用依托泊苷(ETO)誘導細胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂，并通過檢測γH2AX水平，分析突變對MSH5的DNA損傷修復功能的影響:同時，結合文獻信息和蛋白結構預測模型，分析MHS5基因突變對卵巢功能的影響及其在POF發(fā)病中的作用。
　　結果:通過對POF-2家系進行全外顯子組測序研究，我們發(fā)現(xiàn)了位于MSH5基因的純合錯義突變c.1459G＞T(p.D487

10、Y)，散發(fā)性POF患者中未發(fā)現(xiàn)該突變。通過蛋白結構預測模型分析，我們發(fā)現(xiàn)突變p.D487Y位于MSH5的DNA結合功能域內，該位點從酵母到人類高度保守，酵母的同源位點突變可嚴重影響孢子生成。通過在卵巢組織中的定位研究，我們發(fā)現(xiàn)MSH5蛋白不僅在胚胎期的卵巢組織中高表達，而且在發(fā)育期卵泡的卵母細胞、顆粒細胞和卵泡膜細胞中表達。野生型MSH5蛋白能夠促進ETO誘導的DNA雙鏈損傷的修復，而突變型MSH5的功能喪失。
　　結論:MSH5

11、基因突變與家族性POF密切相關。MSH5廣泛表達于卵巢的卵母細胞及其支持細胞中，MSH5基因突變可能通過DNA同源重組修復機制障礙引起卵母細胞及其支持細胞的過度凋亡，卵泡異常閉鎖，最終導致卵巢早衰的發(fā)生。
　　第四部分 FMR1基因前突變與中國漢族卵巢早衰的相關性研究
　　目的:卵巢早衰的遺傳學病因有很大的地域和種族差異。FMR1基因前突變在高加索散發(fā)性POF患者中的發(fā)生率為3.3％-6.7％，被認為是POF的重要致病基因。

12、FMR1前突變攜帶者的后代容易發(fā)生FMR1全突變，導致脆性X綜合征的發(fā)生，因此POF患者被推薦進行FMR1突變篩查。但是，F(xiàn)MR1前突變在中國漢族POF人群中的攜帶情況尚無報道，F(xiàn)MR1突變篩查的必要性有待探討。因此，本研究擬通過在中國漢族POF患者中進行FMR1基因突變篩查，明確FMR1前突變與中國漢族POF的相關性，為遺傳咨詢和生育指導提供理論依據。
　　方法:選取379例中國漢族散發(fā)性POF患者和402例正常對照參與實驗，以

13、外周血基因組DNA為模版，使用熒光標記引物進行PCR擴增，并通過毛細管電泳檢測FMR15'UTR的CGG重復次數(shù)。同時，分析閉經年齡與FMR1基因CGG重復次數(shù)的相關性。
　　結果:FMR1前突變在中國漢族散發(fā)性POF患者中的發(fā)生率僅為0.5％(2/379)，遠低于高加索人群。FMR1中間型（CGG重復41-54次）在POF患者中的發(fā)生率略高于正常對照，但差異無統(tǒng)計學意義(2.9％vs.1.7％，P=0.343)。POF患者的FM

14、R1兩等位基因均比正常對照多一個CGG重復(allele-1;29.7 vs.28.8，P＜0.001; allele-2:32.6vs.31.5，P＜0.001)。攜帶FMR1純合突變型的POF患者比正?；蛐蛿y帶者的閉經年齡提前約4-6年（hom-high/high vs.norm:20.4±4.8 vs.24.7±6.4,P＜0.01; hom-low/high vs.norm:18.7±1.7 vs.24.7±6.4,P＜0.0