急性髓系白血病和非霍奇金淋巴瘤患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂肪成骨分化能力與粘附分子表達(dá)水平比較.pdf

1、急性髓系細(xì)胞性白血病是造血干細(xì)胞異常的惡性疾病。與正常造血干細(xì)胞平衡的增殖分化過(guò)程相比，急性髓系白血病造血干細(xì)胞因持續(xù)增殖而失去進(jìn)一步分化成各類(lèi)血細(xì)胞的能力。近年來(lái)在急性髓系白血病的發(fā)病機(jī)理研究中，越來(lái)越多的證據(jù)表明除了控制造血干細(xì)胞增殖分化凋亡通路的基因（主要包括信號(hào)傳遞分子和轉(zhuǎn)錄因子）的突變，微環(huán)境對(duì)造血干細(xì)胞的增殖分化以及遷移也有重要影響。越來(lái)越多的研究者認(rèn)為造血干細(xì)胞需要特定的微環(huán)境來(lái)維持其干細(xì)胞狀態(tài)，一旦離開(kāi)該特定微環(huán)境或者特

2、定微環(huán)境發(fā)生改變，造血干細(xì)胞則會(huì)轉(zhuǎn)向增殖分化的狀態(tài)。造血干細(xì)胞的特定微環(huán)境主要由基質(zhì)細(xì)胞（可分為間充質(zhì)干細(xì)胞，成骨細(xì)胞，成脂肪細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞）和細(xì)胞外基質(zhì)組成。
　　微環(huán)境中許多組分都被發(fā)現(xiàn)可以調(diào)控造血干細(xì)胞的功能，例如成骨細(xì)胞被報(bào)道可以控制龕的大小，被認(rèn)為是造血干細(xì)胞微環(huán)境的關(guān)鍵組成部分。最近骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞也被發(fā)現(xiàn)是構(gòu)成造血干細(xì)胞微環(huán)境的重要成分，該類(lèi)間充質(zhì)干細(xì)胞缺失的小鼠骨髓中造血干細(xì)胞數(shù)量減少而且歸巢能力也

3、有損傷。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更可進(jìn)一步分化為成骨和成脂肪細(xì)胞，因此骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化能力也是影響造血干細(xì)胞微環(huán)境的因素。除了增殖分化外，造血干細(xì)胞的歸巢能力會(huì)影響臨床上干細(xì)胞移植的效果，而造血干細(xì)胞微環(huán)境中組成細(xì)胞的粘附分子被認(rèn)為與歸巢能力有關(guān)，其中當(dāng)然也包括間充質(zhì)干細(xì)胞和其分化而成的各種細(xì)胞。因此間充質(zhì)干細(xì)胞與急性髓系白血病可能有相關(guān)性。然而關(guān)于臨床上急性髓系白血病患者的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特征/分化能力/粘附分子表達(dá)情況的報(bào)道很少。因

4、此我們分析了急性髓系白血病患者來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特征和成脂肪成骨能力，并用Real-time PCR的方法檢查了相關(guān)基因與粘附蛋白的表達(dá)，與非骨髓病變的非霍奇金淋巴瘤患者和正常對(duì)照進(jìn)行比較，為進(jìn)一步研究間充質(zhì)干細(xì)胞在造血干細(xì)胞微環(huán)境維持上的功能和急性髓系白血病病理研究提供臨床上的數(shù)據(jù)結(jié)果。
　　第一部分急性髓系白血病和非霍奇金淋巴瘤患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特征及成脂肪成骨分化能力比較
　　目的：比較急性髓系白血病患者與非骨

5、髓病變的非霍奇金淋巴瘤患者和正常骨髓來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特征和的成脂肪、成骨分化能力，以及相關(guān)分化基因的表達(dá)分析，以探索其在骨髓造血干細(xì)胞微環(huán)境和急性髓系白血病病理中的功能。
　　方法：急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者共10例，男性6例，女性4例，19～60歲，中位年齡44歲。其中M2四例，M3一例，M4兩例，M5一例，M6一例，未分類(lèi)一例，均經(jīng)骨髓像、流式細(xì)胞術(shù)免疫分型及染色體、融合基

6、因等檢查明確診斷。非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)患者共10例，男性7例，女性3例，34～77歲，中位年齡50歲。其中8例B細(xì)胞性淋巴瘤，2例T細(xì)胞性淋巴瘤，均經(jīng)病理檢查診斷明確。骨髓正常對(duì)照3例，均為男性，19～33歲，中位年齡26歲。選擇每例患者髂后上嵴處抽出骨髓2.5 ML注入EDTA抗凝管中，5ML DPBS稀釋骨髓液，加入3.5ML Ficoll分離液中，2000rpm離心20min，吸取中間

7、交界面單個(gè)核細(xì)胞層，貼壁培養(yǎng)得到梭形骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)。流式細(xì)胞儀鑒定MSCs陽(yáng)性表面標(biāo)記CD105、CD73、CD90，陰性表面標(biāo)記CD45。培養(yǎng)液誘導(dǎo)法誘導(dǎo)MSCs成脂肪成骨分化，并于第14天染色。AML，NHL患者和對(duì)照組取誘導(dǎo)成骨、成脂肪之前和第3、7天為時(shí)間點(diǎn)，提取mRNA，進(jìn)行Real-timePCR檢測(cè)成脂肪基因脂蛋白酯酶基因(Lipoprot

8、ein lipase，LPL)，成骨基因骨橋蛋白基因(Osteopontin，OPN)。
　　結(jié)果：來(lái)源于A(yíng)ML患者/NHL患者/正常對(duì)照的MSCs培養(yǎng)在相同培液中，原代培養(yǎng)時(shí)MSCs呈現(xiàn)紡錘形形態(tài)且有部分圓形懸浮細(xì)胞，AML患者細(xì)胞形態(tài)與其它兩組相比更呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)，分支增加，有不少扁圓形細(xì)胞。培養(yǎng)四代后的三組細(xì)胞都呈現(xiàn)相似的長(zhǎng)梭形形態(tài)。流式細(xì)胞分選顯示細(xì)胞表面MSCs標(biāo)記CD105、CD73、CD90呈陽(yáng)性，而細(xì)胞表面非MSC

9、s標(biāo)記CD45呈陰性。三組細(xì)胞脂肪誘導(dǎo)后，第3天只有AML組看到有脂滴出現(xiàn)。第7天AML組脂滴數(shù)高于其他兩組。14天油紅O染色顯示三組沒(méi)有區(qū)別。脂蛋白酯酶LPL是常用的脂肪細(xì)胞標(biāo)志基因。RT-PCR結(jié)果顯示，AML組和NHL組誘導(dǎo)之后第三天和第七天都顯著上升。未誘導(dǎo)前，AML患者比NHL患者成脂肪基因LPL表達(dá)顯著增加(p＜0.05)，而與正常對(duì)照之間則沒(méi)有顯著差別;成脂肪誘導(dǎo)后后的第3天，第7天三組間的LPL的表達(dá)沒(méi)有區(qū)別。另一方面，

10、AML患者與正常對(duì)照各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都沒(méi)有顯著區(qū)別。成骨誘導(dǎo)后，14天的成骨的染色AML患者弱于其他兩組，但成骨基因OPN的表達(dá)在三組之前和各個(gè)時(shí)期都沒(méi)有區(qū)別。
　　結(jié)論：AML患者的MSCs原代培養(yǎng)時(shí)形態(tài)更不規(guī)則。成脂肪誘導(dǎo)之前LPL表達(dá)顯著增加，誘導(dǎo)之后AML組更早出現(xiàn)脂滴，早期脂滴數(shù)量更多。成骨誘導(dǎo)14天成骨染色AML組弱于其他兩組。
　　第二部分急性髓系白血病和非霍奇金淋巴瘤患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞粘附分子表達(dá)水平比較及臨床意

11、義
　　目的：分析急性髓系白血病患者與非白血病的非霍奇金淋巴瘤患者和正常對(duì)照來(lái)源的骨髓間粘附分子的表達(dá)水平和誘導(dǎo)分化后的變化，以探索其在骨髓造血干細(xì)胞微環(huán)境和急性髓系白血病病理中的功能。
　　方法:急性髓系白血病患者共10例，男性6例，女性4例，19～60歲，中位年齡44歲。其中M2四例，M3一例，M4兩例，M5一例，M6一例，未分類(lèi)一例，均經(jīng)骨髓像、流式細(xì)胞術(shù)免疫分型及染色體、融合基因等檢查明確診斷。非霍奇金淋巴瘤患者共1

12、0例，男性7例，女性3例，34～77歲，中位年齡50歲。其中8例B細(xì)胞性淋巴瘤，2例T細(xì)胞性淋巴瘤，均經(jīng)病理檢查診斷明確。骨髓正常對(duì)照3例，均為男性，19～33歲，中位年齡26歲。選擇每例患者髂后上嵴處抽出骨髓2.5 ML注入EDTA抗凝管中，5ML DPBS稀釋骨髓液，加入3.5ML Ficoll分離液中，2000rpm離心20min，吸取中間交界面單個(gè)核細(xì)胞層，貼壁培養(yǎng)得到梭形MSCs。流式細(xì)胞儀鑒定MSCs陽(yáng)性表面標(biāo)記CD105、

13、CD73、CD90，陰性表面標(biāo)記CD45。培養(yǎng)液誘導(dǎo)法誘導(dǎo)MSCs成脂肪成骨分化，AML，NHL患者和正常對(duì)照取誘導(dǎo)成骨、成脂肪之前和第3、7天為時(shí)間點(diǎn)，提取mRNA，進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)粘附分子E-Cadherin/N-Cadherin。
　　結(jié)果:未誘導(dǎo)前，AML患者、NHL患者粘附分子和對(duì)照組E-cadherin表達(dá)無(wú)顯著差別。成脂肪誘導(dǎo)后，AML患者第3天，第7天E-cadherin的表達(dá)顯著降低(p＜0.0

14、5);第3天AML患者E-cadherin的表達(dá)顯著小于對(duì)照組。成骨誘導(dǎo)后第7天NHL患者和對(duì)照組的E-cadherin的表達(dá)顯著增高(p＜0.05)。第7天AML患者E-cadherin的表達(dá)顯著高于對(duì)照組。與此相對(duì)的是N-Cadherin的表達(dá)在各個(gè)時(shí)期各組之間都沒(méi)有區(qū)別。
　　結(jié)論:AML患者在成脂肪誘導(dǎo)后E-cadherin表達(dá)顯著降低，在第3天AML患者E-cadherin的表達(dá)顯著小于對(duì)照組;成骨誘導(dǎo)后第7天NHL患者

15、和對(duì)照組的E-cadherin的表達(dá)顯著降低。而第7天AML患者E-cadherin的表達(dá)顯著高于對(duì)照組。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn):AML患者的MSCs原代培養(yǎng)時(shí)形態(tài)更不規(guī)則。成脂肪誘導(dǎo)之前LPL表達(dá)顯著增加，誘導(dǎo)之后AML組更早出現(xiàn)脂滴，早期脂滴數(shù)量更多。成骨誘導(dǎo)14天成骨染色AML組弱于其他兩組。AML患者在成脂肪誘導(dǎo)后E-cadherin表達(dá)顯著降低，在第三天AML患者E-cadherin的表達(dá)顯著小于對(duì)照組;成骨誘導(dǎo)后第