伐地那非通過改善氧化應(yīng)激水平治療肺動脈高壓的臨床與基礎(chǔ)研究.pdf

1、肺動脈高壓(pulmonaryarterialhypertension，PAH)是一類多病因、進展性的疾病，其定義為靜息狀態(tài)右心導(dǎo)管(RHC)測定平均肺動脈壓大于等于25mmHg，最終進展為右心衰竭，直至死亡。肺動脈高壓是多種生理途徑和細胞類型引起的多因素的病理生理改變，包括肺血管收縮、增殖，血管阻塞性重構(gòu)，炎性浸潤及原位血栓形成等機制。越來越多的研究表明，氧化應(yīng)激參與了肺動脈高壓的發(fā)病過程。氧化應(yīng)激被定義為氧化物的增加（如過氧化氫、超

2、氧陰離子等）伴或不伴有抗氧化物或抗氧化酶（如超氧化物歧化酶）的降低。增加的氧化物不但能夠通過氧化特定的生物分子，直接損傷組織器官，包括脂質(zhì)過氧化和DNA氧化，而且可以與一氧化氮(NO)結(jié)合，導(dǎo)致毒性分子過氧亞硝酸的產(chǎn)生和內(nèi)皮一氧化氮合成酶(endothelialnitricoxidesynthase，eNOS)的脫偶聯(lián)。
　　在過去幾年里，肺動脈高壓的藥物治療有了很大進展，文獻報導(dǎo)顯示使用靶向藥物治療的肺動脈高壓患者比安慰劑組的死

3、亡率下降了43％，住院率下降了61％31。目前應(yīng)用于肺動脈高壓治療的靶向藥物有以下3類:1）前列環(huán)素類似物;2）內(nèi)皮素受體拮抗劑;3）5-磷酸二酯酶抑制劑。其中5-磷酸二酯酶抑制劑包括西地那非、伐地那非和他達拉非，5-磷酸二酯酶抑制劑在肺血管系統(tǒng)中大量表達。5-磷酸二酯酶抑制劑通過NO/cGMP通路起到擴張血管和抗增殖作用。5型磷酸二酯酶(phosphodiesterase-type5，PDE5)是在肺組織中廣泛表達的的磷酸二酯酶異構(gòu)酶

4、，它能夠在鳥苷酸環(huán)化酶(guanylatecyclase)的作用下降解環(huán)磷酸鳥苷(cyclicguanosinemonophosphate，cGMP)，引起血管收縮。PDE5抑制劑，包括西地那非(sildenafil)和他達拉非（tadalafil），目前已經(jīng)被批準用于肺動脈高壓的臨床治療。
　　伐地那非(vadenafil)，屬于新型PDE5抑制劑。與傳統(tǒng)的PDE5抑制劑相比，它完全溶于水和乙醇，對PDE5的特異性作用更強。20

5、11年，通過一項臨床雙盲、隨機、安慰劑實驗，研究者發(fā)現(xiàn)伐地那非能夠有效的改善PAH患者的運動能力、血流動力學(xué)指數(shù)和心功能，但機制尚不明確。在勃起功能障礙的基礎(chǔ)和臨床研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)除了PDE5抑制功能，PDE5抑制劑還能夠通過抑制氧自由基形成，降低NADPH氧化酶起到強大的抗氧化作用，從而緩解內(nèi)皮功能障礙和血管重構(gòu)，但其他PAH靶向藥物，如依前列醇(epoprostenol)并沒有此功能。Ghofrani等報道給予PAH患者短期伐地

6、那非治療后，顯示雖然伐地那非能引起肺血管收縮，但其對肺循環(huán)血管缺乏特異性，另外，伐地那非中長期治療也有個案報道，顯示其對PAH的治療并沒有特殊效果。因此，伐地那非治療PAH的有效性及耐受性仍值得進一步商榷。
　　2009年，荊志成教授及其課題組，通過對45名PAH患者的研究，顯示1年的伐地那非治療能夠有效地治療PAH。2011年，該課題組繼續(xù)進行了一項隨機、雙盲、安慰劑-對照及多中心的研究。結(jié)果顯示與西地那非和他達拉非不同，伐地那

7、非單藥治療即能夠有效的延緩PAH患者的臨床惡化程度，改善其血流動力學(xué)變化。然而伐地那非治療肺動脈高壓的具體機制仍不明確。
　　鑒于目前伐地那非治療PAH功能研究的缺乏，本課題收入15名特發(fā)性PAH患者，同時以野百合堿誘導(dǎo)的PAH大鼠為體內(nèi)模型，以H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激內(nèi)皮細胞為體外模型，研究伐地那非治療PAH的機制研究和可能涉及的信號通路，為PAH的治療提供了依據(jù)。研究分以下三部分:
　　第一部分伐地那非改善氧化應(yīng)激并治療特

8、發(fā)性肺動脈高壓的臨床研究
　　本研究選擇特發(fā)性肺動脈高壓患者作為研究對象，分析了伐地那非對特發(fā)性肺動脈高壓患者的治療作用，及其對患者體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的改善作用。
　　1)我們選取了EVALUATION研究中的15名特發(fā)性肺動脈高壓的患者，并選擇了年齡及性別與之相匹配的健康人群作為對照。入選患者給予伐地那非每次5mg，每日1次口服1個月，若患者未出現(xiàn)嚴重不良反應(yīng)，則加量至每次5mg，每日2次繼續(xù)口服2個月。
　　2)我們

9、于基線及3個月后評估完成以下內(nèi)容:標準病史與體格檢查，6分鐘步行距離，WHO肺動脈高壓功能分級，血生化指標，心電圖，肺功能檢查，和完整的右心導(dǎo)管檢查所測血流動力學(xué)資料。結(jié)果顯示3個月的伐地那非治療能顯著改善特發(fā)性肺動脈高壓患者WHO功能分級、六分鐘步行距離、心指數(shù)、肺血管阻力等指標。盡管跟用藥前相比較，患者平均肺動脈壓力、肺毛細血管楔壓、平均右房壓力較前有降低，但并沒有統(tǒng)計學(xué)差異。以上結(jié)果說明伐地那非能夠改善肺動脈高壓患者臨床癥狀及血流

10、動力學(xué)變化。
　　3)隨后我們采用商品化試劑盒測量了肺動脈高壓患者及健康對照組血液中一氧化氮、丙二醛、8-異前列素F2α、3-硝基酪氨酸、超氧化物歧化酶等氧化應(yīng)激及氮化應(yīng)激相關(guān)產(chǎn)物的水平。發(fā)現(xiàn)肺動脈高壓患者血漿中氧化損傷產(chǎn)物丙二醛、8-異前列素F2α、3-硝基酪氨酸明顯高于正常人，氧化應(yīng)激保護性產(chǎn)物一氧化氮、超氧化物歧化酶明顯低于正常對照者。伐地那非治療3個月后，氧化損傷產(chǎn)物8-異前列素F2α及3-硝基酪氨酸水平均較前降低，但仍高

11、于正常人，而丙二醛的水平并沒有明顯改變。血管擴張產(chǎn)物一氧化氮較治療前明顯升高，基本恢復(fù)正常水平?？寡趸赋趸锲缁篙^治療前升高，與正常人相比，仍處于較低水平。以上以上結(jié)果顯示，肺動脈高壓患者體內(nèi)存在較高的氧化應(yīng)激水平，抗氧化能力明顯較正常人減弱。而伐地那非治療能夠降低患者的氧化應(yīng)激水平，改善其抗氧化能力，起到保護性作用。
　　第二部分伐地那非改善野百合堿誘導(dǎo)肺動脈高壓大鼠氧化應(yīng)激水平的研究
　　本研究選擇了34只雄性SP

12、F級Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重200-220g，隨機分為正常對照組、野百合堿模型組以及伐地那非治療組。給予50mg/kg野百合堿21天后，伐地那非治療組大鼠予1mg/kg/d灌胃共21天。之后進行如下研究:
　　1)應(yīng)用右心導(dǎo)管檢查術(shù)測量大鼠的血流動力學(xué)指標，發(fā)現(xiàn)MCT組大鼠的mPAP、RVSP和PVR明顯高于正常對照組，而CO則明顯低于正常對照組。給予伐地那非治療后，伐地那非組大鼠的mPAP、RVSP和PVR

13、較MCT組分別降低41％、25％和26％。以上結(jié)果與我們臨床試驗結(jié)果相一致，進一步驗證了伐地那非對血流動力學(xué)的改善作用。
　　2)為研究伐地那非對血流動力學(xué)改善的原因，我們對大鼠肺組織進行了組織學(xué)染色并應(yīng)用相關(guān)軟件對血管組織進行測量。與正常對照組相比，野百合堿組大鼠的％WT和％WA明顯增高。而給予伐地那非治療后，伐地那非組的％WT和％WA明顯降低。以上結(jié)果在＜50μm、50-100μm、100-200μm直徑的肺血管中均有所體現(xiàn)。

14、之后我們通過α-SMA抗體染色，檢測大鼠的血管肌化程度。跟正常對照組相比，野百合堿組血管肌化程度顯著增加，鏡下觀察平滑肌細胞明顯肥大增生。給予伐地那非治療后，伐地那非組肌化程度較MCT組降低了39％，平滑肌細胞增生肥大有所改善。最后我們對肺血管平滑肌細胞進行了PCNA及TUNEL染色，發(fā)現(xiàn)伐地那非對血管厚度的改善是通過誘導(dǎo)大鼠肺動脈平滑肌細胞的增值，同時促進其凋亡而實現(xiàn)的。
　　我們應(yīng)用wersternblot的方法及商品化試劑盒

15、，研究了伐地那非治療肺動脈高壓的相關(guān)機制。與正常對照組相比，野百合堿組大鼠血漿及肺組織內(nèi)NO的濃度降低，.給予伐地那非治療后，跟野百合堿組相比，伐地那非組血漿及肺組織內(nèi)NO水平均較前恢復(fù)。原因是通過伐地那非上調(diào)eNOS蛋白的表達而實現(xiàn)的。之后我們發(fā)現(xiàn)伐地那非能夠改善大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，與我們臨床試驗結(jié)果相一致。為了進一步研究可能的機制，我們選擇了氧化應(yīng)激過程中主要的酶，NADPH氧化酶和超氧化物歧化酶，進行下一步研究。結(jié)果顯示與正常對

16、照組相比，野百合堿大鼠大鼠體內(nèi)NADPH氧化酶催化亞基，NOX2和NOX4，的水平明顯上調(diào)，但激活亞基RAC1水平并沒有明顯變化。伐地那非治療能顯著改善NOX2和NOX4的表達水平，卻同樣不影響RAC1亞基的表達水平。相反，MCT組大鼠體內(nèi)SOD活性較正常對照組相比明顯降低，而伐地那非治療后，SOD活性得到了顯著改善。以上結(jié)果提示，伐地那非對氧化應(yīng)激水平的改善，其中一部分是通過改善NADPH氧化酶和超氧化物歧化酶而實現(xiàn)的。
　　第

17、三部分伐地那非通過BMP信號通路改善內(nèi)皮細胞氧化損傷的機制研究
　　通過第一部分和第二部分的體內(nèi)研究，我們明確了伐地那非能改善氧化應(yīng)激同時治療肺動脈高壓，但具體機制仍不清楚。因此第三部分，我們應(yīng)用CRL-1730內(nèi)皮細胞系為研究模型，給予不同劑量外源性H2O2造成其氧化應(yīng)激損傷，進一步研究了伐地那非對氧化應(yīng)激損傷保護性作用的具體機制。
　　1)通過MTT及TUNEL的方法，我們發(fā)現(xiàn)與對照組比較，H2O2組細胞活力顯著降低，伐

18、地那非各劑量組與H2O2組比較，細胞活力顯著升高，且具有明顯的劑量依賴性。與對照組比較，H2O2組細胞凋亡率顯著增高，給予伐地那非處理后，細胞凋亡率較前明顯改善，且具有劑量依賴性。以上結(jié)果于體內(nèi)試驗結(jié)果相互印證:伐地那非對內(nèi)皮細胞起到了強烈的保護性作用，且該作用呈劑量依賴性。
　　2)之后我們檢測了骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bonemorphogeneticproteins，BMPs）信號通路在各組細胞中的表達，BMP信號通路廣泛參與了肺動

19、脈高壓、動脈粥樣硬化等血管疾病。結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激隨時能夠上調(diào)BMP受體1A、BMP受體1B、BMP受體2，同時上調(diào)胞漿內(nèi)p-smad水平，最后進入細胞核內(nèi)，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子MSX2的表達。而伐地那非能夠改善上述通路，起到保護性作用。
　　3)最后我們應(yīng)用BMP信號通路的抑制劑，Dorsomorphin干預(yù)細胞，并通過TUNEL檢測細胞凋亡情況。我們發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，H2O2組細胞內(nèi)細胞凋亡率顯著增高，伐地那非組與H2O2組比較，細