eNOS和ROS 介導(dǎo)的辛伐他汀對腫瘤血管正?；饔玫某醪窖芯?pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 辛伐他汀對小鼠LLC和B16移植瘤模型中血流灌注的促進(jìn)作用
　　目的:研究辛伐他汀對小鼠腫瘤模型血管結(jié)構(gòu)和功能的影響及其與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用對腫瘤生長的抑制作用。
　　方法:構(gòu)建肺癌(Lewis lung cancer, LLC)和黑色素瘤 B16F10的同系小鼠皮下移植瘤模型,分別給予低劑量(0.2 mg/kg)和高劑量辛伐他汀(10 mg/kg)干預(yù)7天后,小鼠尾靜脈注

2、射 FITC標(biāo)記的番茄凝集素(Lectin),取瘤,組織切片,CD31免疫熒光染色,檢測腫瘤血管形態(tài)結(jié)構(gòu)及灌注情況的變化;B超檢測給藥后血流灌注的功能性改變;采用免疫組化,Western-blot檢測 HIF-1α的表達(dá)及H&E染色分析各組腫瘤組織中乏氧及壞死情況的改變。將移植瘤小鼠隨機(jī)分為4組:空白對照組、單用化療藥物組、化療藥物+0.2 mg/kg辛伐他汀組和化療藥物+10 mg/kg辛伐他汀組,隔天分別測量各組小鼠皮下腫瘤的體積直

3、到治療結(jié)束。
　　結(jié)果:Lectin和CD31雙染結(jié)果顯示,LLC和B16腫瘤模型中,0.2和10 mg/kg辛伐他汀給藥組中Lectin+/CD31+的血管均明顯增多(p<0.05),管腔輪廓更加銳利清晰,0.2 mg/kg辛伐他汀組中血管密度稍有增多,10 mg/kg辛伐他汀組中血管密度降低;B超示0.2和10 mg/kg辛伐他汀給藥組中血管指數(shù)(vascularity index, VI)和血管血流指數(shù)(vasculariz

4、ation flow index, VFI)均顯著高于對照組(p<0.05);辛伐他汀給藥后(低劑量和高劑量),腫瘤組織中HIF-1α+的細(xì)胞數(shù)量顯著減少,HIF-1α表達(dá)亦明顯降低,且壞死區(qū)域的面積顯著減少(p<0.05);0.2或10 mg/kg辛伐他汀聯(lián)合化療時(shí),LLC和B16腫瘤的最終體積均顯著小于單用化療藥物組及空白對照組(p<0.05)。
　　結(jié)論:辛伐他汀可誘導(dǎo)腫瘤血管結(jié)構(gòu)及功能正常化并增強(qiáng)化療藥物的抗腫瘤治療療效。

5、
　　第二部分 低劑量及高劑量辛伐他汀促進(jìn)腫瘤血管正?；木唧w表現(xiàn)及分子機(jī)制
　　目的:進(jìn)一步探討低劑量和高劑量辛伐他汀促進(jìn)腫瘤血管成熟的具體表現(xiàn)及可能的分子機(jī)制。
　　方法:分別在乏氧及常氧條件下,利用體外遷移實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜋z測辛伐他汀干預(yù)后,大分子、FITC標(biāo)記的白蛋白跨單層人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)層的轉(zhuǎn)移量。小鼠LLC及B16皮下移植瘤模型分別給予低劑量(0.2 mg/kg)和高劑量辛伐他汀(10 mg/kg)干

6、預(yù)7天,取瘤,制成冰凍切片,免疫熒光 CD31和α-SMA雙染,檢測腫瘤血管周細(xì)胞的覆蓋率,并采用Western-blot檢測各組 eNOS蛋白的表達(dá)水平;移植瘤小鼠辛伐他汀干預(yù)后尾靜脈注射依文思藍(lán)染料,20 min后,心腔灌注并檢測瘤組織內(nèi)依文思藍(lán)染料的含量;利用CM-H2DCFDA熒光探針進(jìn)行組織原位染色,檢測0.2和10 mg/kg辛伐他汀干預(yù)的LLC和B16腫瘤組織中活性氧自由基(ROS)的產(chǎn)生量,以及相應(yīng) VEGF蛋白水平的變

7、化;為進(jìn)一步探討辛伐他汀的作用機(jī)制,LLC和B16荷瘤小鼠給予腹腔注射一種已知的ROS抑制劑(DPI),并觀察給藥5天后,腫瘤組織中ROS的含量變化、CD31/Lectin染色檢測 DPI給藥后血管密度及灌注情況的改變,同時(shí),Western-blot檢測各組腫瘤組織中VEGF、HIF-1α表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果:體外內(nèi)皮細(xì)胞通透性實(shí)驗(yàn)表明,辛伐他汀可降低乏氧誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞層的通透性,并呈劑量依賴性,在5μM時(shí)降低最明顯。

8、CD31/α-SMA雙染結(jié)果顯示:0.2 mg/kg辛伐他汀組中周細(xì)胞被覆的血管比例顯著增加(p<0.001),并伴隨 eNOS蛋白表達(dá)水平升高,而高劑量辛伐他汀該效應(yīng)不明顯;體內(nèi)血管通透性實(shí)驗(yàn)表明,0.2和10 mg/kg辛伐他汀干預(yù)后腫瘤組織中依文思藍(lán)染料含量顯著降低(p<0.05),高劑量辛伐他汀組降低更明顯;隨著辛伐他汀藥物劑量的提高,腫瘤組織中ROS的含量逐漸減少(p<0.05),且高劑量辛伐他汀顯著降低 VEGF表達(dá);給予

9、DPI干預(yù)后,腫瘤中ROS水平顯著降低,并伴隨著血管密度降低及血流灌注增加(p<0.05),以及VEGF,HIF-1α蛋白水平相應(yīng)降低。
　　結(jié)論:辛伐他汀在體外可顯著降低乏氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮滲漏,并呈劑量依賴性降低;低劑量辛伐他汀主要通過上調(diào) eNOS表達(dá)促進(jìn)周細(xì)胞募集,穩(wěn)定血管,而高劑量辛伐他汀通過降低 ROS誘導(dǎo)的HIF-1α及VEGF表達(dá),緩解由 VEGF介導(dǎo)的腫瘤血管高通透性,二者通過不同的表現(xiàn)形式及分子機(jī)制促進(jìn)腫瘤血管成熟。