APE-Ref-1在大鼠螺旋神經節(jié)細胞表達調控及氧化損傷過程中作用機制的研究.pdf

1、研究背景： 聽覺神經元損傷是感音神經性耳聾的主要原因之一。近年研究發(fā)現耳毒性聾、噪聲性聾、老年性聾以及耳蝸缺血再灌注損傷，都與活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)氧化應激損傷有關，氧化損傷是內耳聽神經元損傷的基本病理過程。無嘌呤/無嘧啶核酸內切酶/氧化還原因子-1(apurinic/apyrimidimic endonuclase/redoxfactorl，APE/Ref-1)是一種具有DNA修

2、復、氧化還原以及調節(jié)轉錄因子活性的多功能蛋白，盡管有研究表明其在多種細胞抗氧化損傷過程中起重要的作用，但其在耳蝸螺旋神經節(jié)細胞(spiral ganglion cells，SGCs)的表達及其在氧化損傷過程中的作用并不清楚。本研究對SGCs進行體外培養(yǎng)，并建立體外氧化損傷模型，對APE/Ref-1在體內、外螺旋神經節(jié)細胞的表達進行檢測，并利用腺病毒載體基因轉染技術與RNA干擾技術對APE/Ref-1在SGCs表達進行正、反調控，研究AP

3、E/Ref-1在螺旋神經節(jié)氧化損傷中的作用。為螺旋神經節(jié)氧化損傷保護研究提供理論依據。 研究目的： 探討APE/Ref-1在耳蝸螺旋神經節(jié)氧化損傷過程中的作用及其機制，為螺旋神經節(jié)氧化損傷保護研究提供理論依據。 研究方法： 1．通過免疫組織化學技術初步了解APE/Ref-1蛋白在耳蝸組織的表達。 2．體外分離并培養(yǎng)大鼠螺旋神經節(jié)細胞48小時后，采用不同濃度H202(0，10,25,50，100,3

4、00μmol/L)干預1小時，換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，采用MTT方法、TUNEl方法分別檢測螺旋神經節(jié)在H<,2>O<,2>氧化環(huán)境下細胞活力、細胞凋亡情況。 3．構建重組腺病毒載體Ad-APE/Ref-1，轉染體外培養(yǎng)螺旋神經節(jié)細胞，通過指示蛋白綠色熒光蛋白(GFP)的表達，檢測不同倍數(MOI)的感染率，以及感染后24h，48h和72h時GFP表達感染率，確定合適的感染倍數和病毒表達時間。 4．采用RT-PC

5、R和Western Blot檢測Ad-APE/Ref-1感染螺旋神經節(jié)細胞內APE/Ref-1的mRNA和蛋白表達。檢測通過腺病毒感染介導能否有效的引起螺旋神經節(jié)細胞過度的表達APE/Ref-1。采用MTT方法、TUNEL方法分別檢測轉染后螺旋神經節(jié)在H<,2>O<,2>氧化環(huán)境下的細胞活力、細胞凋亡情況。 5．構建靶向APE/Ref-1基因短發(fā)夾狀干擾RNA(short hairpin RNA，shRNA)表達載體PGenes

6、ill-APE/Ref-1，并采用LipofectaminieTM2000脂質體將其轉染螺旋神經節(jié)細胞。根據綠色熒光指示蛋白估計感染率。 6．采用RT-PCR和Western Blot檢測PGenesill-APE/Ref-1感染螺旋神經節(jié)細胞內APE/Ref-1的mRNA和蛋白表達。檢測通過RNA干擾是否有效的抑制了APE/Ref-1在螺旋神經節(jié)細胞的表達。采用MTT方法、TLINEL方法分別檢測轉染后螺旋神經節(jié)在H<,2>O

7、<,2>氧化環(huán)境下的細胞活力、細胞凋亡情況。 研究結果： 1．APE/Ref-1在大鼠耳蝸螺旋神經節(jié)、螺旋韌帶、血管紋、Corti器部位有較高表達，陽性細胞成棕黃色。 2．在培養(yǎng)條件下SGCs生長良好，接種24小時后可見典型的雙極神經元，極少數成三極神經元。48小時后，SGCs長出較長的突起，培養(yǎng)4天后，SGCs突起進一步伸長，交織成網絡，非神經細胞停止增殖。培養(yǎng)8天后細胞開始死亡，10天后存活細胞明顯減少，不能

8、傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)48小時后用神經元特異烯淳化酶(NSE)抗體進行免疫學鑒定，大部分SGNs全細胞呈現紅色免疫熒光，胞核明顯，少數僅胞體染色。 3．隨H<,2>O<,2>濃度升高，細胞活性呈現下降趨勢，H<,2>O<,2>濃度為50，100,300uml/L時，OD值分別為0.1917±0.0217，0.1542±0.0165，0.1322±0.0151，與對照組比較有統(tǒng)計學意義，P值均小于0.01。而細胞凋亡呈明顯上升趨勢，H<,

9、2>O<,2>濃度為50,100,300uml/L時，螺旋神經節(jié)細胞的凋亡率分別為14.41±1.68％，25.52±1.71％，43.51±2.13％，與對照組之間差異具有統(tǒng)計學意義，P值均小于0.01。 4．通過同源重組，在AD293細胞內產生了具有感染能力的Ad-APE/Ref-1腺病毒顆粒；通過反復感染過程，獲得較高滴度腺病毒液。 5．Ad-APE/Ref-1、Ad-GFP感染SGCs后，GFP表達陽性隨MOI和

10、時間增加而增加；MOI到達150以上時，細胞GFP陽性率達到90％以上，感染48小時后，GFP陽性表達趨于穩(wěn)定，因此確定感染48小時后作為進行后續(xù)實驗的適宜時間。 6．RT-PCR和Wetem Blot結果顯示，攜帶外源基因APE/Ref-1的腺病毒后，SGCs能夠過度表達APE/Ref-1的mRNA和蛋白。 7．MTT結果顯示：APE/Ref-1在SGCs過表達后，螺旋神經節(jié)細胞在H<,2>O<,2>(50，100，3

11、00μmol/L)氧化環(huán)境中細胞活性相對于對照組顯著升高(P<0.01)。而細胞凋亡相對于對照組成下降趨勢。(P<0.01)。 8．在大鼠APE/Ref-1全長序列中選取含21個核苷酸靶序列，設計形成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表達載體pGenesil-1中，獲得可靶向抑制APE/Ref-1基因的重組shRNA(short laairpin RNA，shRNA)表達載體PGenesill-APE/Ref-1。

12、 9．采用Lipofectamine<'TM>2000脂質體將PGenesill-APE/Ref-1轉染到螺旋神經節(jié)細胞，繼續(xù)培養(yǎng)72小時后，RT-PCR和Wetem Blot結果顯示，APE/Ref-1在螺旋神經節(jié)細胞的表達受到抑制，約40～50％。 10．APE/Ref-1在螺旋神經節(jié)細胞表達受到抑制后，螺旋神經節(jié)細胞在H<,2>O<,2>(25，50，100,300μmol/L)氧化環(huán)境中細胞活性相對于對照組顯著降低。而細

13、胞凋亡相對于對照組成上升趨勢，有統(tǒng)計學意義，P<0.05。 結論： 1．APE/Ref-1在耳蝸螺旋神經節(jié)、螺旋韌帶、血管紋、Corti器部位有較高水平的表達。 2．成功分離并培養(yǎng)出大鼠SGCs，通過不同濃度H<,2>O<,2>誘導SGCs氧化損傷，建立了SGCs體外氧化損傷模型。 3．成功構建了腺病毒載體Ad-APE/Ref-1。 4．通過重組腺病毒介導，SGCs細胞內APE/Ref-1過度表達

14、能夠顯著提高SGCs的抗氧化能力，提示APE/Ref-1過表達對SGCs細胞氧化損傷有保護作用。 5．成功構建了靶向抑制APE/Ref-1基因的重組shRNA表達載體PGenesill-APE/Ref-1。 6．通過RNA干擾，抑制SGCs細胞APE/Ref-1蛋白表達能夠降低螺旋神經節(jié)細胞的抗氧化能力，提示APE/Ref-1對SGCs在氧化環(huán)境中的存活起著關鍵作用。 7．APE/Ref-1對SGCs的氧化損傷保