高遷移率族蛋白B1與晚期糖基化終產(chǎn)物受體對前列腺癌PC-3細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、前列腺癌是歐美國家男性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，在美國其死亡率僅次于肺癌居第二位。據(jù)美國癌癥協(xié)會估計，美國2015年前列腺癌發(fā)病患者將達(dá)到220800人，占男性所有惡性腫瘤的26％，其死亡人數(shù)較前雖有輕微下降，但仍將達(dá)到27540人。我國前列腺癌的發(fā)病率雖低于西方國家，但由于生活方式西化、人口老齡化及前列腺特異抗原(PSA)篩查的普及，近10年來前列腺癌的發(fā)病率和死亡率均呈明顯上升趨勢，且增長比歐美發(fā)達(dá)國家更為迅速。
　　由于前列腺癌

2、早期發(fā)病隱匿，患者確診時不少已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因而失去了根治性治療的最佳時機(jī)。隨著直腸指診（DRE）聯(lián)合PSA應(yīng)用篩查的普及，前列腺癌早期診斷率有了顯著的提高。但是PSA的敏感性和特異性皆存在一定的局限性，致使其在臨床應(yīng)用上仍存在一些爭議。當(dāng)以血清PSA＞10ng/ml為參考值時，臨床漏診率為25％;當(dāng)PSA值位于臨床診斷灰區(qū)的4～10ng/ml時，僅有30％的患者被診斷為前列腺癌。治療上，根治性治療（根治性前列腺切除術(shù)、外放射治療）是目前

3、局限性前列腺癌最有效的治療方法，但部分根治性治療的早期前列腺癌患者仍有復(fù)發(fā)的可能。轉(zhuǎn)移性前列腺癌的治療目前主要依靠內(nèi)分泌治療，但是往往因逐漸對激素非依賴而發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌（CRPC），使治療變得更加困難。由此，當(dāng)前需要迫切尋找新的特異性和敏感性均較高的前列腺癌標(biāo)志物以及潛在的治療新靶點(diǎn)，盡可能做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預(yù)、早治療，并且進(jìn)一步提高療效，這是當(dāng)前前列腺癌研究的重要課題。
　　但前列腺癌發(fā)生發(fā)和進(jìn)展的分子機(jī)制至今仍

4、不清楚。以往的研究表明，前列腺癌的發(fā)生發(fā)展與染色體畸形、野生型p53、p16、PTEN、mn23、NKX3.1、Rb等抑癌基因的失活，c-myc、c-met、ras等癌基因的異常表達(dá)，AR、PSA、VDR等基因多態(tài)性及TMPRSS2-ERG基因融合等過程有關(guān)。而近年的研究表明，高遷移率族蛋白B1（HMGB1）及其主要受體晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)也與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　HMGB1是高遷移率族蛋白B（HMGB）家

5、族成員，因在聚丙烯酰胺凝膠電泳時的快速遷移而得名。HMGB1早期命名為兩性素（amphoterin），是一種存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白。細(xì)胞核內(nèi)的HMGB1參與穩(wěn)定核小體結(jié)構(gòu)、DNA重組和修復(fù)、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄及類固醇激素調(diào)控等生命活動。胞內(nèi)HMGB1還可以由炎癥細(xì)胞主動分泌或者壞死細(xì)胞被動分泌進(jìn)入胞外。胞外的HMGB1同時是損傷相關(guān)分子模式（DAMP）分子，參與許多腫瘤相關(guān)炎癥的發(fā)生。它能作為一種信號分子，由細(xì)胞核內(nèi)的分

6、泌到細(xì)胞外，在免疫、炎癥、自噬、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移及腫瘤增殖轉(zhuǎn)移等病理生理過程中發(fā)揮重要作用。胞外HMGB1的受體包括RAGE、Toll樣受體家族(Toll-like receptor，TLR)、CD24、IL-1R、髓系細(xì)胞觸發(fā)受體1(TREM-1)等。細(xì)胞外的HMGB1可以通過與其受體結(jié)合，主要是通過與RAGE結(jié)合，廣泛地參與了腫瘤的發(fā)生、生長、浸潤及轉(zhuǎn)移等過程。
　　RAGE最早是Neeper等從牛肺中獲得的。它是一種單跨膜

7、蛋白，屬于免疫球蛋白超家族跨膜受體。人RAGE編碼基因位于Ⅲ類主要組織相容性復(fù)合物（MHCⅢ）區(qū)域。人RAGE由404個氨基酸組成，位于細(xì)胞膜上，由胞外段、跨膜段和胞內(nèi)段組成。RAGE在人體生理情況下呈低水平表達(dá)（除成熟Ⅰ型肺泡細(xì)胞和胚胎細(xì)胞外），而在糖尿病、自身免疫病、神經(jīng)變性疾病、血管疾病及腫瘤等疾病中表達(dá)顯著增高。RAGE作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體介導(dǎo)其配體結(jié)合在單核巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎系膜細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及多種腫瘤細(xì)胞

8、表面，激活細(xì)胞內(nèi)部各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，發(fā)生病理效應(yīng)。RAGE雖然是由于與晚期糖基化終產(chǎn)物(AGE)相互作用被發(fā)現(xiàn)并因此得名，但其配體除AGE之外，還包括HMGB1，β-淀粉樣多肽（amyloid-β peptide），S100蛋白等，這些配體分別與RAGE相互作用，激活相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)，在各種疾病中扮演著不同的角色。
　　近些年來，HMGB1與RAGE對腫瘤的作用越來越受到人們的關(guān)注。目前已發(fā)現(xiàn)HMGB1/R

9、AGE軸與包括結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、惡性間皮瘤等惡性腫瘤密切相關(guān)。研究認(rèn)為，HMGB1及其受體RAGE可調(diào)控這些腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而阻斷RAGE與其配體HMGB1的相互作用，能夠抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。HMGB1/RAGE軸與前列腺癌的作用關(guān)系是近年才被發(fā)現(xiàn)的。2003年，Kuniyasu等對40名術(shù)前經(jīng)促性腺激素釋放激素(LHRH)抑制劑去勢治療的pT3期前列腺癌患者的術(shù)后標(biāo)本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞及間

10、質(zhì)細(xì)胞中的RAGE和HMGB1呈高表達(dá)，在有轉(zhuǎn)移的患者中更明顯;進(jìn)一步的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)在阻斷雄激素后，HMGB1/RAGE系統(tǒng)可通過旁分泌途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞的相互作用，從而促進(jìn)前列腺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。2005年Ishiguro等研究發(fā)現(xiàn)HMGB1和RAGE在未經(jīng)治療的前列腺癌組織和激素難治性前列腺癌組織中的mRNA水平表達(dá)較正常前列腺組織明顯增高。在3種前列腺癌細(xì)胞株(DU145，PC-3和LNCaP細(xì)胞)中，發(fā)現(xiàn)在DU145即

11、激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株中，RAGE表達(dá)最高。HMGB1在上述3個細(xì)胞株中均有表達(dá)。2012年Elangovan等通過體外動物實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過特異性阻斷HMGB1/RAGE軸能抑制前列腺腫瘤生長。
　　在我們前期的工作中，我們通過免疫組化證實(shí)在組織水平，HMGB1和RAGE在前列腺癌組織中存在高表達(dá)，HMGB1和RAGE蛋白的表達(dá)以及兩者的共表達(dá)與前列腺癌的浸潤深度、局部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，進(jìn)一步對隨訪資

12、料進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析后發(fā)現(xiàn)， HMGB1和RAGE的共表達(dá)與晚期前列腺癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　目的：
　　HMGB1和RAGE在前列腺癌中是否存在相互作用，及其相互作用對前列腺癌生物學(xué)行為（增殖、遷移、凋亡等）有何影響及可能存在的作用機(jī)制。在細(xì)胞水平進(jìn)一步探索及驗(yàn)證。這將為HMGB1和RAGE對前列腺癌診斷、治療和評估的意義提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為前列腺癌的臨床診治提供新的思路和方法。
　　方法：

13、r>　　基于以上認(rèn)識，本研究首先進(jìn)行用Western Blot檢測3種前列腺癌細(xì)胞系及前列腺增生細(xì)胞系中HMGB1蛋白的表達(dá)情況;利用免疫熒光技術(shù)觀察HMGB1在前列腺癌細(xì)胞系和前列腺增生細(xì)胞系的定位情況;利用瓊脂糖親和柱(Ni-IDA)純化獲得外源性HMGB1蛋白;接著利用CCK-8檢測外源性HMGB1刺激下前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖情況;然后用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察外源性HMGB1刺激下前列腺癌PC-3細(xì)胞的遷移情況;再利用Annexin

14、-V-FITC凋亡試劑盒檢測外源性HMGB1對PC-3凋亡能力的影響。利用免疫熒光觀察HMGB1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)一步用Western Blot驗(yàn)證HMGB1過表達(dá)模型;接著分別利用CCK-8檢測、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、凋亡試劑盒檢測過表達(dá)HMGB1下對前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖、遷移情況、凋亡能力的影響。利用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)干擾前列腺癌PC-3細(xì)胞RAGE的表達(dá);在沉默RAGE情況下，分別用CCK-

15、8檢測、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、凋亡試劑盒檢測外源性HMGB1對PC-3增殖、遷移和凋亡能力的影響，以觀察HMGB1與RAGE在前列腺癌細(xì)胞中的相互作用。
　　結(jié)果：
　　1.前列腺癌細(xì)胞高表達(dá)HMGB1;HMGB1在前列腺增生細(xì)胞系和前列腺癌細(xì)胞系主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，在細(xì)胞質(zhì)中也有表達(dá)。
　　2.成功純化得到His-HMGB1融合蛋白。
　　3.外源性HMGB1呈濃度依賴性及時間依賴性促進(jìn)前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖;外源性

16、HMGB1刺激前列腺癌細(xì)胞可促進(jìn)其遷移能力;外源性HMGB1刺激前列腺癌細(xì)胞可促進(jìn)其抗凋亡能力。
　　4.觀察HMGB1質(zhì)粒在前列腺癌PC-3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，并成功構(gòu)建過表達(dá)HMGB1的前列腺癌細(xì)胞模型。
　　5.過表達(dá)HMGB1蛋白可促進(jìn)前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖、遷移和抗凋亡能力。
　　6.利用RNAi技術(shù)成功沉默前列腺癌PC-3細(xì)胞RAGE蛋白的表達(dá)。
　　7.沉默RAGE后，HMGB1促進(jìn)前列腺癌PC-3細(xì)