自噬在心衰小鼠中的時(shí)序性變化、機(jī)制及干預(yù)研究.pdf

1、背景：
　　 心力衰竭是各種心血管疾病發(fā)展的終末階段，具有較高的發(fā)病率和死亡率。近年來(lái)各種藥物治療使心力衰竭患者的生活質(zhì)量大大提高，但其生存率仍無(wú)明顯改善。究其原因，主要是其發(fā)病機(jī)制還不十分清楚。自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種溶酶體依賴性的降解途徑，細(xì)胞通過(guò)單層或雙層膜包裹待降解物形成自噬小體，然后運(yùn)送到溶酶體形成自噬溶酶體并進(jìn)行多種酶的消化及降解，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自身的代謝和細(xì)胞器的更新，自噬對(duì)維持細(xì)胞的自身穩(wěn)態(tài)具有重要意義。最近

2、的研究表明自噬在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。因此闡明自噬在心衰中的確切作用，有助于進(jìn)一步了解心衰的發(fā)病機(jī)制，為心衰的有效防治提供新的思路和策略。然而，目前自噬在心衰中的具體作用尚不明了，自噬在心衰中的時(shí)序性表達(dá)變化和對(duì)心肌的產(chǎn)生有利或有害作用值得進(jìn)一步探討。
　　 目的：
　　 建立小鼠主動(dòng)脈弓縮窄(Transverseaorticarchconstriction，TAC)模型，觀察TAC小鼠心衰進(jìn)展過(guò)程

3、中自噬功能的時(shí)序性變化，并探討心衰過(guò)程中自噬功能紊亂的可能機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)Ⅰ：
　　 方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)分組
　　 170只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常組（50只），假手術(shù)組（50只）和心衰組（70只）。各組分別于0天、3天、7天、14天、28天處死8-11只小鼠。
　　 2.動(dòng)物模型的建立
　　 小鼠腹腔注射0.08％戊巴比妥鈉麻醉、固定后，在大體顯微鏡下行TAC術(shù)。在頸部中

4、心位置作一縱行10mm切口，鈍性分離左、右頸總動(dòng)脈，于雙側(cè)頸總動(dòng)脈分支處盲穿并結(jié)扎主動(dòng)脈弓，27號(hào)針頭與主動(dòng)脈弓一同結(jié)扎后，抽出針頭，以控制主動(dòng)脈弓狹窄率(60±5％)。假手術(shù)組的手術(shù)步驟同上，但不結(jié)扎主動(dòng)脈弓。
　　 3.存活率分析
　　 保留存活記錄并繪制曲線圖。
　　 4.超聲心動(dòng)圖檢測(cè)
　　 所有小鼠于處死前行經(jīng)胸壁超聲心動(dòng)圖檢測(cè)，計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)（Ejectionfraction，EF％）、左室

5、重量(Leftventricularmassweight，LVMW)。
　　 5.組織病理學(xué)及免疫組織化學(xué)染色檢查
　　 留取小鼠心臟標(biāo)本，行蘇木素-伊紅染色(Haematoxylineosin，HE)、Masson染色，觀察心臟大體形態(tài)學(xué)改變;行免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)心肌內(nèi)各指標(biāo)的表達(dá):
　　 (1)自噬指標(biāo):微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（Microtubule-associateprotein1lightchain3，

6、LC3）、Bcl-2相互作用蛋白(Bcl-2interactingcoiled-coilprotein-1,Beclin-1)、Beclin-1相互作用蛋白(RUNdomainproteinasBeclin1-interactingandcysteine-richcontaining,Rubicon)、P62(Sequestosome1/SQSTM1);
　　 (2)炎癥指標(biāo):單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Monocytechemoat

7、tractantprotein-1,MCP-1)、細(xì)胞間粘附分子-1(Intercellularadhesionmolecule-1，ICAM-1)、Toll樣受體4(Toll-likereceptor4，TLR4)、髓樣分化因子88(Myeloiddifferentiationfactor88，Myd88)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(Tissuein

8、hibitorofmatrixmetalloprotease-1，TIMP-1);
　　 (3)氧化應(yīng)激指標(biāo):4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal，4-HNE)、8-羥基-2'-脫氧鳥(niǎo)苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine，8OHdG）。
　　 6.實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-timequantitativepolymerasechainreaction,Real-timePCR):檢

9、測(cè)心肌內(nèi)LC3a、LC3b、自噬相關(guān)基因(Autophagy-relatedgene,Atg)Atg5、Atg7、Rubicon、Beclin-1的表達(dá)。
　　 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，所有數(shù)據(jù)用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組數(shù)據(jù)間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用包含Bonferronipost-hoc檢驗(yàn)的單因素或雙因素方差分析。多組間的兩兩比較采

10、用費(fèi)希爾的LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般情況
　　 本研究共120只小鼠進(jìn)行了手術(shù)，50只為假手術(shù)組，只掛線不結(jié)扎主動(dòng)脈弓，1只死于麻醉意外，其余全部存活;70只為心衰組，TAC手術(shù)當(dāng)天存活小鼠56只，手術(shù)成功率為80％。
　　 2.心臟超聲學(xué)檢測(cè)結(jié)果
　　 心臟超聲圖像顯示術(shù)后28天心衰組小鼠左心室室壁變薄，心腔明顯擴(kuò)大，心肌收縮力減退。與正常

11、組和假手術(shù)組相比，心衰組小鼠術(shù)后EF％明顯下降，術(shù)后第3天由術(shù)前的73.4±3.5％降至41±10.4％（P＜0.01）;術(shù)后7天至28天EF％下降較緩慢，術(shù)后28天小鼠EF％為36.2±5.7％(P＜0.01)。心衰組小鼠術(shù)后LVMW較正常組和假手術(shù)組顯著增高(P＜0.05)，術(shù)后3天LVMW由42.2±10.2增至52.5±12.7，術(shù)后28天增至58.2±11.0。
　　 3.病理學(xué)檢測(cè)
　　 (1)病理學(xué)染色

12、r>　　 HE染色和Masson染色均顯示隨著心衰時(shí)間的延長(zhǎng)，心衰組小鼠心肌細(xì)胞直徑增大，心臟橫徑和左心室腔不斷增大。術(shù)后28天心肌纖維化明顯，與正常組和假手術(shù)組比較具有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 (2)自噬因子表達(dá)變化
　　 與正常組和假手術(shù)組相比，心衰組小鼠心肌LC3表達(dá)明顯增高，呈雙峰分布，在3天和7天表達(dá)持續(xù)升高，在7天達(dá)到第一個(gè)峰值（P＜0.01）;在14天略有降低(P＜0.05或P＜0

13、.01);在28天表達(dá)明顯增強(qiáng)，達(dá)到第二個(gè)峰值（P＜0.01）。與正常組和假手術(shù)組相比，心衰組小鼠心肌Beclin-1表達(dá)在術(shù)后3天和7天，明顯升高（P＜0.01）。
　　 與正常組和假手術(shù)組相比，心衰組小鼠心肌P62表達(dá)在7天和28天顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 與正常組和假手術(shù)組相，心衰組小鼠心肌Rubicon的表達(dá)在術(shù)后3天、7天、14天、28天均顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)。
　

14、　 (3)炎癥因子表達(dá)變化
　　 與正常組和假手術(shù)組相比，心衰組小鼠心肌MCP-1表達(dá)明顯升高，呈雙峰分布，在3天表達(dá)較高（P＜0.01），在7天表達(dá)略有減低(P＜0.05或P＜0.01)，在14天和28天又持續(xù)升高（P＜0.01）。
　　 與正常組和假手術(shù)組相比，心衰組小鼠心肌ICAM-1表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均顯著升高，在7天、28天表達(dá)較高（P＜0.01），3天、14天表達(dá)略低（P＜0.05）。與正常組和假手術(shù)組相比，心

15、衰組小鼠心肌MMP-9表達(dá)在14天、28天表達(dá)略有升高(P＜0.05)。
　　 與正常組和假手術(shù)組相比，心衰組TIMP-1表達(dá)在28天顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)，余無(wú)顯著性差異。
　　 與正常組和假手術(shù)組相比，心衰組TLR4表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均顯著升高，并隨時(shí)間不斷增強(qiáng)，與正常組和假手術(shù)組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 與正常組和假手術(shù)組相比，心衰組小鼠Myd88表達(dá)在14天

16、顯著升高（P＜0.05），余無(wú)顯著性差異。
　　 (4)氧化應(yīng)激因子表達(dá)變化
　　 心衰組小鼠心肌80HdG的表達(dá)明顯增強(qiáng)，術(shù)后3天陽(yáng)性率為24.18±6.63％，較假手術(shù)組(10.40±4.54％)和正常組(3.13±1.33％)顯著增強(qiáng)（P＜0.05或P＜0.01）;術(shù)后7天略下降至11.58±3.05％;術(shù)后14天、28天又持續(xù)上升(分別為28.56±7.31％,P＜0.05;30.79±7.47％，P＜0.01)

17、。心衰組小鼠心肌4-HNE表達(dá)也顯著增強(qiáng)，在術(shù)后3天升高至正常組的6-7倍，7天略下降至3-4倍，14天、28天又升高至4-6倍，與正常組和假手術(shù)組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 4.Real-timePCR結(jié)果
　　 與正常組和假手術(shù)組比較，心衰組小鼠心肌LC3amRNA的水平隨時(shí)間呈單峰分布，在7天達(dá)到最高（P＜0.01），余時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著性差異;
　　 與正常組和假手術(shù)組比較，心衰組LC3b的mR

18、NA表達(dá)水平也呈單峰分布，在3天、7天表達(dá)最高（P＜0.05），28天恢復(fù)到正常水平;
　　 與正常組和假手術(shù)組比較，心衰組小鼠心肌Atg5mRNA表達(dá)水平在3天、7天、14天明顯增高(P＜0.01)，在28天基本降至基礎(chǔ)水平;
　　 與正常組和假手術(shù)組比較，心衰組小鼠心肌Atg7mRNA表達(dá)水平在3天明顯升高（P＜0.01），達(dá)到高峰，在28天基本降至基礎(chǔ)水平，余時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　

19、與正常組和假手術(shù)組比較，心衰組小鼠心肌Beclin-1mRNA表達(dá)水平表現(xiàn)為在第3天顯著升高（P＜0.01），在7天、14天迅速降至基礎(chǔ)水平，在28天略有升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 與正常組和假手術(shù)組比較，心衰組小鼠心肌Rubicon的mRNA表達(dá)水平隨時(shí)間呈雙峰分布，在7天、28天達(dá)到最高值（P＜0.01），14天略有降低（P＜0.05）。
　　 實(shí)驗(yàn)Ⅱ：
　　 方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)

20、動(dòng)物
　　 180只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常組（50只），假手術(shù)組（50只）和心衰組（80只）。以上各組組內(nèi)又隨機(jī)分為3個(gè)亞組:雷帕霉素組、雷帕霉素加氯喹組和生理鹽水組，共9個(gè)亞組。各亞組分別于TAC術(shù)后7天、28天處死8-10只小鼠，小鼠處死前4h分別給予腹腔注射雷帕霉素(30mg/kg)或（和）氯喹(2mg/kg)或生理鹽水(0.2ml)。
　　 2.動(dòng)物模型的建立
　　 動(dòng)物模型的建立方法同實(shí)驗(yàn)Ⅰ

21、。
　　 3.病理學(xué)檢測(cè)
　　 LC3免疫組化檢測(cè)各組心肌LC3的蛋白表達(dá)水平。
　　 4.Real-timePCR檢測(cè)
　　 檢測(cè)各組LC3a、LC3b的mRNA表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.病理學(xué)染色
　　 在不應(yīng)用雷帕霉素和氯喹干預(yù)情況下，術(shù)后7天心衰組小鼠心肌LC3表達(dá)陽(yáng)性率為21.43±2.9％，術(shù)后28天達(dá)28.20±3.24％，與正常組和假手術(shù)組比較均具有顯著性

22、差異（P＜0.01）。
　　 術(shù)后7天，雷帕霉素均可以引起正常組、假手術(shù)組和心衰組小鼠心肌LC3表達(dá)水平的升高(P＜0.05);雷帕霉素和氯喹聯(lián)合應(yīng)用可以引起正常組、假手術(shù)組小鼠心肌LC3表達(dá)的進(jìn)一步升高（P＜0.01）。在心衰組中，雷帕霉素和氯喹組的LC3表達(dá)與雷帕霉素組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。
　　 術(shù)后28天，在正常組和假手術(shù)組中，雷帕霉素可以引起LC3蛋白表達(dá)的升高（P＜0.05或P＜0.01），雷帕霉

23、素和氯喹聯(lián)合應(yīng)用可以引起LC3蛋白表達(dá)的進(jìn)一步升高(P＜0.05或P＜0.01)。在心衰組中，雷帕霉素組LC3表達(dá)較生理鹽水組略有升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;雷帕霉素和氯喹組LC3表達(dá)與雷帕霉素組相比顯著下降（P＞0.05）。
　　 2.Real-timePCR結(jié)果
　　 與正常組和假手術(shù)組相比，心衰組小鼠心肌LC3a的mRNA水平在術(shù)后7天明顯升高，達(dá)正常組的100-120倍(P＜0.01);術(shù)后28天降至接

24、近正常水平(P＞0.05)。
　　 TAC術(shù)后7天，雷帕霉素可以引起正常組和假手術(shù)組LC3a的mRNA水平的升高(P＜0.05)，心衰組LC3amRNA水平略有升高，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。雷帕霉素和氯喹聯(lián)合應(yīng)用均可以進(jìn)一步升高各組LC3a的mRNA水平。(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 TAC術(shù)后28天，雷帕霉素可以引起正常組、假手術(shù)組和心衰組的LC3a的mRNA水平的升高（P＜0.05或P＜0.01），

25、雷帕霉素和氯喹聯(lián)合應(yīng)用可以進(jìn)一步升高正常組和假手術(shù)組LC3a的mRNA水平（P＜0.05或P＜0.01）。但在心衰組中，雷帕霉素和氯喹組與雷帕霉素組相比，LC3a的mRNA水平?jīng)]有進(jìn)一步升高，反而迅速降低(P＜0.01)。
　　 與正常組和假手術(shù)組相比，心衰組小鼠心肌LC3b的mRNA水平在術(shù)后7天明顯升高，達(dá)正常組的3-5倍(P＜0.05);在術(shù)后28天略有升高，無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　 TAC術(shù)后7天，雷

26、帕霉素均可誘導(dǎo)正常組、假手術(shù)組和心衰組LC3b的mRNA水平的升高(P＜0.05或P＜0.01);雷帕霉素與氯喹聯(lián)合應(yīng)用均引起各組LC3b的mRNA水平的進(jìn)一步升高(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 TAC術(shù)后28天，雷帕霉素均可誘導(dǎo)正常組、假手術(shù)組和心衰組LC3b的mRNA表達(dá)(P＜0.05或P＜0.01);雷帕霉素與氯喹聯(lián)合應(yīng)用可進(jìn)一步誘導(dǎo)正常組、假手術(shù)組LC3b的mRNA表達(dá)（P＜0.01），但在心衰組中，雷帕霉素和氯

27、喹組LC3b表達(dá)與雷帕霉素組相比有所升高，但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　 3.自噬流的改變
　　 免疫組化及PCR結(jié)果均顯示:心衰組小鼠在TAC術(shù)后7天，心肌自噬功能正常;與正常組和假手術(shù)組比較，心衰組雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬流無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。術(shù)后28天，心衰組小鼠心肌自噬功能異常，與正常組和假手術(shù)組比，心衰組雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬流明顯減少甚至消失(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.