阿爾茨海默病患者外周血Aβ抗體和細(xì)胞因子的變化.pdf

1、老年性癡呆又稱(chēng)阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)，是一種好發(fā)于中老年人的神經(jīng)退行性變疾病，以記憶丟失和認(rèn)知功能障礙為典型臨床表現(xiàn)。其病因目前尚不清楚，大多認(rèn)為是一種多病因疾病，與遺傳、增齡、免疫功能異常、感染有關(guān)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)盡管象AD等神經(jīng)退行性疾病不被認(rèn)為是經(jīng)典的炎癥或免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的疾病，但在一定程度上自身免疫反應(yīng)或炎癥反應(yīng)在AD的病因和病理過(guò)程中具重要作用。已在AD的神經(jīng)病變中發(fā)現(xiàn)抗原提呈、人類(lèi)組

2、織相容性抗原(HLA)-DR陽(yáng)性和其他免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞、補(bǔ)體成分、炎性細(xì)胞因子(CK)及急性期反應(yīng)物。而損傷的神經(jīng)元和神經(jīng)突觸、Aβ沉積和神經(jīng)原纖維纏結(jié)很明顯正是特定皮質(zhì)區(qū)慢性炎癥的刺激物。另外，來(lái)自實(shí)驗(yàn)及臨床的研究資料提示AD動(dòng)物模型及AD患者的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)功能異常。AD患者與健康老年人血清和腦脊液中T、B及細(xì)胞因子等出現(xiàn)明顯差異，表明免疫反應(yīng)至少是AD的次級(jí)或終末過(guò)程，且可能參與了系統(tǒng)免疫反應(yīng)。 本研究通過(guò)比較AD

3、患者與健康老年人的體液免疫和細(xì)胞免疫的變化，為AD發(fā)病的免疫異常機(jī)制提供佐證，也為本課題組研發(fā)的Aβ疫苗實(shí)施AD免疫治療的進(jìn)一步研究提供臨床依據(jù)。 1材料和方法 1.1 AD患者入選標(biāo)準(zhǔn)(NINCDS-ADRDA)及分型 (1)臨床檢查確認(rèn)癡呆，MMSE(簡(jiǎn)易精神狀態(tài)量表)，HDS-R(修訂的長(zhǎng)谷川智能量表)(<24)和ADL(日常活動(dòng)量表)量表(>20)等神經(jīng)心理測(cè)試支持； (2)2個(gè)或者2個(gè)以上認(rèn)知功

4、能障礙； (3)進(jìn)行性加重的記憶和其它智能障礙； (4)無(wú)意識(shí)障礙，可伴有精神和行為異常； (5)發(fā)病年齡40～90歲； (6)排除其它可導(dǎo)致進(jìn)行性記憶和認(rèn)知功能障礙的腦部疾病，行頭顱CT或MRI檢查； (7)癡呆分型：MMSE<10為重度；MMSE得分在10～24范圍內(nèi)(其中包括10分和24分)為輕中度。 1.2實(shí)驗(yàn)分組 本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象AD患者和對(duì)照組均來(lái)自廣州市老人院，從200

5、6年6月至2007年4月。對(duì)照組為同期健康老人，共19例，平均年齡(69.80±2.28)(61～89)歲，其中男女比例為4/15，MMSE平均得分(27.86±1.61)(26～30)；研究組中隨機(jī)選擇AD患者29例，根據(jù)MMSE評(píng)分分型：MMSE<10歸為重度AD患者組，共10例，平均年齡(76.00±3.69)(62～92)歲，其中男女比例為2/8，MMSE平均得分(2.64±1.58)(0～10)；MMSE得分在10～24范圍內(nèi)

6、(其中包括10分和24分)歸為輕中度AD患者組，共19例，平均年齡(75.82±2.54)(56～89)歲，其中男女比例為8/11，MMSE平均得分(16.3±2.71)(13～20)。所有被檢對(duì)象均遵循知情同意和有關(guān)倫理要求。 1.3 AD患者血清中抗Ap42抗體的水平 分批于清晨8：00～9：00空腹?fàn)顟B(tài)下采集健康老年人和AD患者肝素鈉抗凝靜脈血5 ml，分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，取最上層分離的血清，分裝置-7

7、0℃凍存。間接ELISA法檢測(cè)健康老年人和AD患者血清中抗Aβ<,42>抗體的水平。 1.4.AD患者外周血細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子的變化 分批于清晨8：00～9：00空腹?fàn)顟B(tài)下采集健康老年人和AD患者肝素鈉抗凝靜脈血5 ml，分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞亞群水平；Aβ<,42>與外周血單核細(xì)胞(PBMC)共刺激培養(yǎng)，ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)經(jīng)Aβ<,42>刺激的PBMC培養(yǎng)上清液中IFN-γ和IL-4

8、的水平；ELISPOT檢測(cè)經(jīng)Aβ<,42>刺激的PBMC中分泌IFN-γ和IL-4細(xì)胞頻數(shù)。 1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所得數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，利用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)量資料多組均數(shù)比較采用方差分析。 2結(jié)果 2.1 AD患者血清中抗Aβ<,42>抗體水平的變化 ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)照組、輕中度AD組、重度AD組血清中抗Aβ<,42>抗體A

9、值分別為1.05±0.31、0.84±0.31和0.64±0.14。輕中度AD組、重度AD組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013<0.05和P=0.004<0.01)。輕中度組與重度組比較，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.035<0.05)。 2.2 AD患者外周血淋巴細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子的變化 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組、輕中度AD患者組、重度AD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞CD19分別為(15.64±9.30)﹪、(

10、11.44±4.33)﹪和(11.06±5.62)﹪：CD4分別為(42.50±11.60)﹪、(29.0±8.27)﹪和(26.83±5.70)﹪；CD8分別為(16.88±7.29)﹪、(21±5.78)﹪和(23.78±13.19)﹪；CD4/CD8分別為2.24、1.38、1.27。綜合比較，輕中度AD組及重度AD組CD8較對(duì)照組均顯著性升高(P=0.048<0.05和P=0.035<0.05)；而輕中度、重度AD組CD4較對(duì)照

11、組顯著降低(P=0.015<0.05和P=0.006<0.01)；輕中度、重度AD組CD19與對(duì)照組比較僅輕微下降，差異無(wú)顯著性；輕中度、重度AD組CD4/CD8較對(duì)照組顯著降低(P=0.034<0.05和P=0.026<0.05)。輕中度AD組和重度AD組之間CD19、CD8、CD4及CD4/CD8差異均無(wú)顯著性(P=0.913>0.05、P=0.665>0.05、P=0.624>0.05和P=0.504>0.05). 對(duì)照組

12、、輕中度AD組、重度AD組體外培養(yǎng)的PBMC經(jīng)特異性抗原Aβ<,42>刺激后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ的含量分別為(76.13±24.15)pg/ml、(30.53±7.88)pg/ml、(26.74±5.35)pg/ml。輕中度和重度AD組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ的含量較對(duì)照組的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ的含量低，且有顯著性差異(P=0.045<0.05和P=0.032<0.05)；重度AD組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ的含量較輕中

13、度AD組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ的含量低，但無(wú)顯著性差異(P=0.478>0.05)。體外培養(yǎng)的三組PBMC經(jīng)特異性抗原Aβ<,42>刺激后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4均<4 pg/ml，與眾多文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。三組體外培養(yǎng)的PBMC經(jīng)特異性抗原Aβ<,42>刺激后，每4×10<'5>個(gè)PBMC中分泌的IFN-γ的細(xì)胞數(shù)分別為15.06±7.22、6.42±4.63、5.83±7.78；分泌的IL-4的細(xì)胞數(shù)均未檢測(cè)出。輕中度AD組和重

14、度AD組分泌IFN-γ的細(xì)胞較對(duì)照組分泌IFN-γ的細(xì)胞少，且輕中度AD組和重度AD組與對(duì)照組比較，有顯著性差異(P=0.007<0.01和P=0.003<0.01)，輕中度AD組分泌IFN-γ的細(xì)胞較重度AD組分泌IFN-γ的細(xì)胞多，兩組比較，差異無(wú)顯著性(P=0.817>0.05)。 3結(jié)論 1.AD患者血清中抗Aβ<,42>抗體水平明顯下降，且與病情程度有關(guān)，表明AD患者與健康老年人之間Aβ特異性的體液免疫應(yīng)答存在

15、顯著差異，AD患者的特異性的體液免疫應(yīng)答較健康老年人顯著下降。 2.AD患者與健康老年人外周血PBMC的CD表面標(biāo)志分子也存在差異，輕中度及重度AD患者CD8顯著性升高、CD4和CD4/CD8顯著降低；而CD19變化不明顯。但輕中度和重度AD患者之間，外周血中CD19、CD4、CD8及CD4/CD8差異無(wú)顯著性。表明輕中度AD患者及重度AD患者外周淋巴細(xì)胞亞群發(fā)生改變。 3.體外培養(yǎng)的AD患者與健康老年人外周血PBMC經(jīng)

16、特異性抗原Aβ<,42>刺激后，細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-4均<4 pg/ml。AD患者細(xì)胞培養(yǎng)液中IFN-γ的含量降低，以重度AD患者較為明顯，但與輕中度AD患者比較無(wú)顯著性差異。表明特異性抗原Aβ<,42>能有效刺激體外培養(yǎng)的三組。PBMC分泌IFN-γ，并從細(xì)胞因子的總體水平上證實(shí)了AD患者的Aβ<,42>特異性細(xì)胞免疫功能受損。 4．體外培養(yǎng)的AD患者與健康老年人外周血PBMC經(jīng)特異性抗原Aβ42刺激后，輕中度和重度AD患者每4