結(jié)核分枝桿菌RD2區(qū)五種蛋白的原核表達(dá)、免疫特性及其診斷價(jià)值的初步探究.pdf

1、結(jié)核病(Tuberculosis，TB)在全球范圍內(nèi)廣泛地引起人和動(dòng)物發(fā)病甚至死亡，引發(fā)重大的經(jīng)濟(jì)損失。早期準(zhǔn)確診斷和對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核病人的及時(shí)治療，減少結(jié)核發(fā)病率及降低死亡率非常重要。在結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染者中，超過95％表現(xiàn)為潛伏性結(jié)核感染(latenttuberculosisinfection，LTBI)，若在HIV感染或自身免疫性疾病致使機(jī)體免疫力低下情況下，LTBI日后可

2、發(fā)展成為活動(dòng)性結(jié)核，成為主要的傳染源，因此TB感染及時(shí)檢測(cè)對(duì)于控制結(jié)核病至關(guān)重要。目前應(yīng)用最為廣泛的診斷方法是結(jié)核菌素試驗(yàn)(tuberculinskintest，TST)，該診斷方法是一種以純化蛋白衍生物(PPD)或舊結(jié)核菌素(OT)為抗原進(jìn)行皮下注射的診斷方法，其特異性較差，診斷結(jié)果假陽性率較高。因此迫切需要研究開發(fā)出特異性好、便于臨床應(yīng)用的鑒定方法。近年來引人注目的是對(duì)于結(jié)核分枝桿菌特異性抗原診斷價(jià)值的研究進(jìn)展，因?yàn)楸容^基因組學(xué)提供

3、了大量特異性抗原信息，并發(fā)現(xiàn)了16個(gè)MTB特異性差異區(qū)域(RD)。因此本研究選取RD2區(qū)域中的5種蛋白進(jìn)行原核融合表達(dá)與純化，對(duì)它們免疫特性進(jìn)行了初步分析，并對(duì)其牛結(jié)核血清學(xué)診斷價(jià)值進(jìn)行比較研究。
　　 1.結(jié)核分枝桿菌RD2區(qū)五種抗原蛋白的原核表達(dá)、純化和鑒定
　　 選取MTBRD2區(qū)5種蛋白R(shí)v1981、Rv1983、Rv1985、Rv1986和Rv1988作為研究對(duì)象，利用PCR擴(kuò)增了相應(yīng)的編碼基因，經(jīng)克隆篩選和測(cè)

4、序鑒定正確后，利用pEASY-E1、pET-30a(+)及pET-32a(+)質(zhì)粒構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒。鑒定正確的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)原核表達(dá)菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果顯示誘導(dǎo)后各目的蛋白均得到成功表達(dá)，對(duì)可溶形式表達(dá)的融合蛋白直接進(jìn)行鎳柱親和層析純化，對(duì)以包涵體形式表達(dá)的融合蛋白在進(jìn)行變復(fù)性后進(jìn)行鎳柱親和層析純化。Western-blotting結(jié)果表明，在使用抗His單抗及兔抗TB多抗血清反應(yīng)后都出現(xiàn)了特異

5、性目的條帶，表明融合蛋白具有較高的免疫反應(yīng)性。同時(shí)，對(duì)這幾種分子的深入研究提供了條件。
　　 2.融合蛋白免疫原性分析及其牛結(jié)核診斷價(jià)值評(píng)價(jià)
　　 取Rv1981、Rv1983、Rv1985、Rv1986四種融合蛋白分別皮下免疫C57BL/6小鼠，100μg/只，每次免疫間隔兩周，于二免二周后取脾臟淋巴細(xì)胞進(jìn)行免疫學(xué)試驗(yàn)。利用夾心ELISA試驗(yàn)檢測(cè)四種蛋白作為刺激抗原活化淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-2和IL-4水平，結(jié)

6、果顯示:Rv1985與Rv1983刺激細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的能力最強(qiáng)，Rv1981刺激細(xì)胞產(chǎn)生IL-4的能力最強(qiáng)，而產(chǎn)生IFN-γ能力在所有蛋白中最弱。
　　 為評(píng)價(jià)上述蛋白抗原在牛結(jié)核血清學(xué)診斷中的潛能，我們進(jìn)行了刺激試驗(yàn):將Rv1981、Rv1983、Rv1985、Rv1986四種融合蛋白純化產(chǎn)物作為包被抗原，通過間接ELISA方法檢測(cè)臨床采集牛血漿上清中特異性抗體，結(jié)果顯示陽性符合率分別為:Rv1981為22％(15/68)

7、、Rv1983為35.3％(24/68)、Rv1985為36.7％(25/68)及Rv1986為32.4％(22/68)。四種蛋白中，Rv1985與BovinePPD有較高的協(xié)同性，顯示該蛋白擁有較高診斷潛能。此后將上述四種融合蛋白純化產(chǎn)物作為刺激劑刺激奶牛外周血，IFN-γ檢測(cè)試劑盒檢測(cè)其活化抗原特異性細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ水平，檢測(cè)的陽性符合率分別為30％(6/20)、20％(4/20)，50％(10/20)及35％(7/20)，顯示在