Ang-1在多發(fā)性骨髓瘤中的表達和青蒿琥酯、β-欖香烯抗骨髓瘤效應.pdf

1、第一部分 Ang-1在多發(fā)性骨髓瘤中的表達及臨床意義
　　 目的:骨髓血管新生在多發(fā)性骨髓瘤(multipie myeloma,MM)的發(fā)生、發(fā)展和預后中起著重要的作用,血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)在此過程中扮演了重要角色。本課題旨在研究Ang-1及其受體Tie-2在MM患者和骨髓瘤細胞株RPMI-8226中的表達情況,探討其表達水平變化的臨床意義。
　　 方法:采用RT-PCR和Weste

2、rn blot法檢測112例MM患者、24例非腫瘤患者(下稱對照組)以及RPMI-8226細胞株中Ang-1及其受體Tie-2的表達水平,分析陽性率及表達量在MM患者與對照組、MM不同分期問的差異,探討Ang-1表達與MM患者骨髓微血管密度、臨床分期及預后的關系。
　　 結果:MM組Ang-1表達的陽性率、表達量均顯著高于對照組(P＜0.05);Ang-1在初治組和復發(fā)/難治MM組的表達陽性率無明顯差異(P＞0.05),但復發(fā)/

3、難治MM組的Ang-1表達量高于初治組(P＜0.05);Tie-2mRNA僅在12例MM患者中檢出,對照組未檢出。MM患者骨髓微血管密度明顯高于對照組(25.21±0.8 vs5.23±0.2,P＜0.01);Ang-1陽性患者的骨髓微血管密度高于Ang-1陰性患者(32.98±1.7 vs16.55±1.3,P＜0.05);Ang-1蛋白在Ⅱ期和Ⅲ期MM患者的表達陽性率差異無統(tǒng)計學意義(52.1％ vs60.9％,P＞0.05),但Ⅲ

4、期MM患者Ang-1蛋白的表達水平明顯高于Ⅱ期患者(0.4±0.07 vs0.22±0.04,P＜0.05);初治患者中,治療無效組Ang-1蛋白表達陽性率明顯高于有效組(19.1％ vs70.0％,P＜0.01)。
　　 結論:Ang-1在MM中高表達;Ang-1表達水平與MM臨床分期、判斷預后及選擇靶向治療有關。
　　 第二部分青蒿琥酯抑制人骨髓瘤細胞誘導的血管新生
　　 目的:觀察青蒿琥酯對人骨髓瘤細胞株R

5、PMI-8226細胞誘導的血管新生的影響,并探討其機制。
　　 方法:采用MTT法觀察青蒿琥酯對人骨髓瘤細胞株RPMI-8226細胞增殖的影響;采用HUVEC遷移實驗、HUVEC小管成型實驗、主動脈環(huán)血管生成實驗和雞胚絨毛尿囊膜(CAM)體內(nèi)血管生長實驗觀察青蒿琥酯對RPMI-8226細胞誘導血管新生的影響;采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測青蒿琥酯對RPMI-8226細胞分泌VEGF租Ang-1的影響;免疫蛋白印跡法檢測青蒿琥酯對RPMI

6、-8226細胞VEGF和Ang-1蛋白表達的影響,
　　 結果:
　　 1青蒿琥酯以時間、劑量依賴方式抑制人骨髓瘤細胞株RPMI-8226細胞增殖。藥物作用24 h和48 h后,其IC50值分別為36.33±2.65和14.31±3.28μmol/l。
　　 2青蒿琥酯在較低濃度(2.5μmol/l)即開始對血管內(nèi)皮細胞遷移有抑制作用;12.5μmol/1時即可抑制內(nèi)皮小管形成。
　　 3主動脈環(huán)血管生成

7、實驗結果顯示,與單純RPMI-8226細胞組相比,青蒿琥酯預處理組新生血管形成明顯減少,出現(xiàn)時間明顯滯后。第14天,單純RPMI8226細胞組新生血管數(shù)為114.5±1.87;3、6和12μmol/l青蒿琥酯預處理組新生血管數(shù)分別為60.33±1.86、34.83±2.14和10±1.41,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 4雞胚絨毛尿囊膜(CAM)體內(nèi)血管生長實驗結果顯示,單純RPMI-8226細胞組具有很強的刺激血

8、管新生能力;而ART處理組的RPMI-8226細胞刺激血管新生能力明顯減弱,3、6和12μmol/l青蒿琥酯處理RPMI-8226細胞組與單純RPMI8226細胞組比較,微血管數(shù)目分別減少21.9％,38.24％和76.9％。
　　 5青蒿琥酯抑制人骨髓瘤細胞株RPMI-8226細胞分泌VEGF和Ang-1。與單純RPMI-8226細胞對照組上清液中VEGF、Ang-1含量(578±26、185.14±32 pg/ml)相比,經(jīng)

9、3、6和12μmol/l青蒿琥酯處理的RPMI8226細胞條件培養(yǎng)液中VEGF、Ang-1含量下降,分別為502±27、145±21;227±35、65±18:121±14、36±6 pg/ml。
　　 6青蒿琥酯抑制人骨髓瘤細胞株RPMI-8226細胞VEGF和Ang-1蛋白表達。與單純RPMI8226細胞對照組相比,經(jīng)3、6和12μmol/l青蒿琥酯處理的RPMI8226細胞VEGF蛋白表達量分別下降28.2％、57.1％和

10、73.6％;Ang-1蛋白表達量分別下降28.9％、44.4％和71.1％,呈劑量依賴性。
　　 結論:青蒿琥酯抑制人骨髓瘤RPMI-8226細胞增殖;青蒿琥酯抑制人骨髓瘤RPMI-8226細胞誘導的血管新生;青蒿琥酯抗骨髓瘤細胞誘導血管新生的效應與其抑制RPMI-8226細胞的VEGF、Ang-1表達有關。
　　 第三部分β-欖香烯對人骨髓瘤細胞增殖與凋亡的影響
　　 目的:研究β-欖香烯對人骨髓瘤細胞系RPM

11、I-8226增殖、凋亡的影響,探討其作用的分子機制
　　 方法:用MTT法檢測β-欖香烯對人骨髓瘤細胞系RPMI-8226增殖的影響;Annexin V/PI雙標流式術和Hoechst33342/PI熒光染色檢測β-欖香烯對RPMI-8226骨髓瘤細胞凋亡的影響;Western blot法檢測β-欖香烯對RPMI-8226骨髓瘤細胞Bcl-2、Caspase-3、DR-4和NF-κB p65蛋白表達影響。
　　 結果:β

12、-欖香烯對RPMI-8226骨髓瘤細胞生長具有明顯抑制作用,且呈濃度和時間依賴性(r=0.723,P＜0.05);10～80μmol/L范圍β-欖香烯作用48 h后可誘導骨髓瘤細胞凋亡。與對照組凋亡率(5.4％±1.1％)相比,β-欖香烯處理組凋亡率隨藥物濃度而遞增,分別為22.1％±3.8％(10μmol/L)、39.5％±3.1％(20μmol/L)、58.4％±2.8％(40μmol/L)、65.4％±2.1％(80μmol/L)