心肌營養(yǎng)素-1對大鼠心肌轉(zhuǎn)錄因子GATA-4作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)的主要目的即為探討CT-1是否對GATA-4的轉(zhuǎn)錄及DNA結(jié)合活性產(chǎn)生影響。 研究方法：本實(shí)驗(yàn)研究了10-12mol/L、10-11mol/L、10-10mol/L、10-9mol/L或10-8mol/LCT-1作用10分鐘、15分鐘、30分鐘、1小時、2小時、3小時、6小時、12小時、24小時或48小時后，對培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)GATA-4基因轉(zhuǎn)錄和DNA結(jié)合活性的影響；觀察了指示心肌肥大遺傳表型改變的ANPmRNA

2、表達(dá)水平變化和CT-1作用下心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變；同時還記錄了GATA-4的協(xié)同作用心肌轉(zhuǎn)錄因子Csx/Nkx2-5和MEF2C在CT-1刺激后的基因轉(zhuǎn)錄情況。 研究結(jié)果：為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)過程的有效性，首先觀察了CT-1對ANP基因轉(zhuǎn)錄的影響。ANPmRNA表達(dá)在對照組里幾乎檢測不到。10-10mol/LCT-1刺激后3小時開始引起ANP基因轉(zhuǎn)錄增加，且其表達(dá)水平隨作用時間的延長而逐步升高，在24和48小時達(dá)到最大值。10-11mol

3、/L的低濃度CT-1就可以引起ANP表達(dá)的增加，其mRNA水平與CT-1濃度增加成正比，在10-9mol/LCT-1作用下達(dá)到峰值，繼續(xù)增加CT-1濃度并不能引起ANPmRNA的更高水平。 隨后，觀察了CT-1及血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)作用下的心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，心肌細(xì)胞在補(bǔ)充了10-9mol/LCT-1或10-8mol/LAngⅡ的無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)48小時后，通過抗心肌α-肌動蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色，

4、可以觀察到，AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大在細(xì)胞長度和寬度上均勻增加；而CT-1引起的肥大心肌細(xì)胞發(fā)生特征性的長度增加，寬度增加很少或無明顯增加。 對照組的心肌細(xì)胞中即可檢測到基礎(chǔ)水平的GATA-4DNA結(jié)合活性，該活性在10-10mol/LCT-1刺激15分鐘后呈1.27倍于基礎(chǔ)值的快速增強(qiáng)，30分鐘時升高到1.45倍，1小時達(dá)到最高活性水平(1.78倍)，在3小時時重新恢復(fù)到基礎(chǔ)活性狀態(tài)。CT-1在10-12mol/L的極低濃度

5、即可引起GATA-4活性增強(qiáng)，10-11mol/LCT-1作用下繼續(xù)加強(qiáng)，10-10mol/LCT-1引起6.6倍于對照組的最顯著的DNA結(jié)合活性升高。隨后即使CT-1的濃度仍呈指數(shù)增加，GATA-4活性卻逐漸下降。 為探討GATA-4DNA結(jié)合活性增強(qiáng)是通過轉(zhuǎn)錄水平還是轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)的，研究了CT-1對GATA-4mRNA表達(dá)的影響。10-10mol/LCT-1作用10分鐘到3小時間并未引起GATA-4轉(zhuǎn)錄的明顯變化，6小時

6、后GATA-4表達(dá)水平有2倍的提高，在12和24小時達(dá)到峰值(均為2.4倍)。劑量依賴實(shí)驗(yàn)中，GATA-4mRNA水平隨CT-1濃度的增加而逐步增長，在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計的最高濃度CT-1(10-8mol/L)作用下增高到5.9倍于基礎(chǔ)表達(dá)水平。 CT-1亦可引起Csx/Nkx2-5轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，其作用在1小時即可被觀察到，在3、6和12小時增加到約2.4倍于對照組水平的最大值，且這三個時間點(diǎn)間Csx/Nkx2-5表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異。Cs

7、x/Nkx2-5mRNA表達(dá)在10-11mol/LCT-1刺激下開始增高，10-10mol/L條件下繼續(xù)增加，在10-9mol/L和10-8mol/LCT-1濃度水平時均達(dá)到約6倍于基礎(chǔ)值的增多。 此外，MEF2C在任何濃度及觀察時間的CT-1作用下都沒有明顯的轉(zhuǎn)錄水平改變。 研究結(jié)論：GATA-4及其協(xié)同作用心肌轉(zhuǎn)錄因子Csx/Nkx2-5，與他們的DNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，可能在CT-1所致的心肌細(xì)胞肥大中起作用。