心肌營養(yǎng)素1在缺氧后適應(yīng)中對心肌保護作用的探討.pdf

1、隨著人們物質(zhì)生活水平不斷提高，不健康的生活方式逐漸增多，威脅人類健康的疾病譜也隨之發(fā)生改變。近10年來，在我國冠心病發(fā)病率增加了2-3倍，急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)發(fā)生率增加了2倍以上，冠心病成為繼腫瘤和腦血管疾病之后的第三位人類健康殺手。因此，治療急性心肌梗死、搶救瀕?；颊叩纳惋@得尤為重要，而且任務(wù)艱巨。目前治療急性心肌梗死不外乎以下三種方法:經(jīng)典藥物治療、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療以

2、及冠狀動脈旁路移植術(shù)治療。經(jīng)過長期的臨床觀察發(fā)現(xiàn)，不論選擇哪一種治療方式，AMI患者在開通病變血管恢復(fù)遠端供血以后，心肌梗死面積都進一步擴大，心臟舒張和收縮功能也會發(fā)生障礙，或者出現(xiàn)嚴重的心律失常，甚至導(dǎo)致死亡，這就是心肌缺血再灌注損傷(Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury，MIRI)現(xiàn)象。所以，緩解心肌再灌注損傷已經(jīng)成為AMI治療過程中迫切需要解決的問題。
　　 1986年，Murry等

3、提出心肌在經(jīng)受多次短暫重復(fù)心肌缺血再灌注后能夠預(yù)防或者減輕隨后的長時間缺血所致的心肌損傷，即缺血預(yù)適應(yīng)(IschemicPreconditioning，IPC)。隨后的臨床研究證實了其心肌保護作用，但是因為操作問題和倫理原則導(dǎo)致臨床應(yīng)用受到限制。2003年趙志清等首先發(fā)表了關(guān)于缺血后適應(yīng)(Ischemic Postconditioning， Postcon)的研究報道，證實用缺血再灌注模型，在冠狀動脈再灌注開始前進行短暫、重復(fù)的開通及關(guān)

4、閉，隨后可以恢復(fù)冠狀動脈血流，該措施能夠限制心肌梗死的范圍、減輕缺血心肌組織水腫和中性粒細胞聚集、改善內(nèi)皮細胞的功能。因此，Postcon可能成為解決再灌注損傷這一問題的有效的途徑之一。Postcon即心肌缺血后再灌注時進行短暫重復(fù)的開通及再閉，隨后完全恢復(fù)血流，其保護機制是一個多因素參與的復(fù)雜過程。無論從動物實驗?zāi)Ｐ?、臨床實驗還是細胞實驗，Postcon的心肌保護作用都已經(jīng)得到充分的證明。Postcon的處理方法，由于其時間可預(yù)測、操

5、作相對簡單，使得其較缺血預(yù)適應(yīng)更適合于臨床治療，它的應(yīng)用前景也更為廣闊。然而，Postcon通過何種機制減輕MIRI尚無明確結(jié)論。隨著對缺血后適應(yīng)研究的不斷深入，有許多學(xué)者對Postcon的心肌保護機制提出各種假說，如再灌注損傷生存激酶(reperfusion injury salvage kinase，RISK)途徑（主要由磷脂酰肌醇-3-激酶PI3K-Akt和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK1/2構(gòu)成），線粒體ATP敏感性K通道(KATP)

6、，以及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道(mitochondrial permeabilitytransition pore，mPTP)等等。Postcon心肌保護機制至今尚未被完全闡明，目前公認的機制包括減少氧自由基的產(chǎn)生，抑制線粒體內(nèi)鈣超載和減輕內(nèi)皮功能失調(diào)等被動機制，再灌注損傷生存激酶(reperfusion injury salvage kinase，RISK)途徑的激活和其他蛋白激酶的產(chǎn)生等主動機制，多數(shù)學(xué)者認為主動機制在心肌保護中占主要地

7、位。RISK途徑主要由促生存激酶磷脂酰肌醇3-激酶-Akt通路（phosphatidy lionsitol3-kinase-Akt，PI3K-Akt）和促進細胞分裂蛋白激酶(mitogen-aetivated protein kinase，MEK1/2)-細胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK1/2(MEK1/2-ERK1/2)通路構(gòu)成。Akt是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，目前被認為是Postcon的關(guān)鍵酶之一。內(nèi)皮型氧化亞氮合酶(eNOS)是PI3K-

8、Akt途徑的主要下游靶點，激活的Akt主要通過促進下游底物如合成酶激酶-3B等的磷酸化而發(fā)揮廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，包括抗凋亡、促細胞生存等功能。Postcon激活了Akt的磷酸化，增加了線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道(mPTP)對鈣離子超載的抵抗從而發(fā)揮保護作用。
　　 多數(shù)學(xué)者認為Postcon無論從主動還是被動渠道的激活均可使細胞的壞死或凋亡情況減輕，因此對于心肌細胞保護因子的研究成為熱點。作為心臟靶向的細胞因子心肌營養(yǎng)素1(CT-1)就

9、是其中一員，CT-1是Pennica在1995年首次從小鼠心臟胚胎干細胞中克隆得到的細胞因子，具有促使體外細胞肥大的作用。隨后的研究發(fā)現(xiàn)CT-1屬于白細胞介素6(IL-6)超家族一員，存在于多種組織，在心肌細胞中表達最高，也是迄今為止能在體外誘導(dǎo)心肌細胞肥大最強的細胞因子。CT-1水平的正常表達對心臟的正常發(fā)育，維護心臟的正常功能起關(guān)鍵作用，大量的研究發(fā)現(xiàn)CT-1參與心肌梗死后的修復(fù)過程，減輕由缺氧復(fù)氧而引起的細胞損傷，從而明顯改善左室

10、舒縮功能，縮小梗死面積。Al-Mazroua，HA等研究發(fā)現(xiàn)左心室收縮功能不全的患者血漿CT-1水平顯著高于正常人，CT-1的水平與左心室衰竭的嚴重程度也有關(guān)，這提示血漿CT-1濃度可能是反映心衰嚴重程度的敏感指標。CT-1如何參與Postcon心肌的保護作用尚不完全清楚，李菊香等的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CT-1能通過激活ERK1/2信號通路減輕由缺氧復(fù)氧而引起的心肌細胞損傷，國外其他研究發(fā)現(xiàn)CT-1也參與PI3K-Akt信號通路。
　　

11、 本實驗通過對培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞株進行缺氧復(fù)氧，CT-1，信號通路阻斷劑等相關(guān)因素的干預(yù)，探討CT-1在缺血后適應(yīng)中對心肌細胞保護作用機制及參與的信號通路。
　　 目的：
　　 探討心肌營養(yǎng)素1在缺血后適應(yīng)中對心肌細胞保護作用機制及參與的信號通路。
　　 方法：
　　 1.細胞培養(yǎng):將水浴鍋預(yù)熱至37℃，紫外線照射30min的超凈工作臺臺面，用75％酒精擦拭，在超凈工作臺中按次序擺放消過毒的離心管、吸管、

12、培養(yǎng)瓶等等。從液氮中取出凍存的H9C2細胞。迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中解凍，并不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再放入超凈臺內(nèi)。制備細胞懸液，將細胞轉(zhuǎn)移至一個15ml離心管內(nèi)，一滴一滴地加入預(yù)熱好的培養(yǎng)基，同時一邊晃動離心管;加入培養(yǎng)基的量要達到10ml以上。在低速離心機上，以800rpm離心5分鐘;吸去上清，然后用1ml培養(yǎng)基重懸細胞;活細胞計數(shù)，從1ml細胞懸液中取20ul加入臺盼藍染色液，染色

13、5分鐘;在血球計數(shù)板上計數(shù)活細胞數(shù)。將符合細胞計數(shù)要求的細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃和5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時（或者24-48小時）后換液繼續(xù)培養(yǎng)，換液的時間由細胞貼壁情況而定。復(fù)蘇細胞正常傳2、3代后，取指數(shù)生長期的細胞進行實驗。培養(yǎng)基為DMEM-高糖培養(yǎng)基添加10％胎牛血清。
　　 2.實驗分為六組，相關(guān)因素干預(yù):正常對照組:細胞用含10％新生牛血清的DMEM液正常培養(yǎng)，不經(jīng)任何處理。缺氧復(fù)氧組:缺氧，用

14、pH6.8 D-Hanks液在缺氧培養(yǎng)箱(95％N2，5％CO2，37℃)培養(yǎng)3h;復(fù)氧，缺氧3h之后用把pH6.8D-Hanks換成含10％新生牛血清DMEM液，在MCO-17AICO2培養(yǎng)箱(95％(O)2，5％CO2:，37℃)復(fù)氧3h。缺氧復(fù)氧+心肌營養(yǎng)素-1組:缺氧3h后加心肌營養(yǎng)素-1+復(fù)氧3h。缺氧后適應(yīng)組:同缺氧復(fù)氧組，在復(fù)氧之前施加5 min復(fù)氧/5 min缺氧3個循環(huán)。缺氧后適應(yīng)+心肌營養(yǎng)素1組:同缺氧復(fù)氧組，在缺氧

15、3h后加入10ug/l心肌營養(yǎng)素1，再施加5min復(fù)氧/5min缺氧3個循環(huán)。復(fù)氧3h。缺氧后適應(yīng)+心肌營養(yǎng)素1+Akt抑制劑組:在缺氧完成前30min加入20umol/l Akt抑制劑，缺氧完成后加入10ug/l心肌營養(yǎng)素1，再施加5min復(fù)氧/5min缺氧3個循環(huán)。復(fù)氧3h。缺氧后適應(yīng)+心肌營養(yǎng)素1+二甲基亞砜組:Akt抑制劑換為二甲基亞砜，其他同缺氧后適應(yīng)+心肌營養(yǎng)素1+Akt抑制劑組。
　　 3.對處理后的細胞進行檢測:

16、使用Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)的multiscan MK3型號酶標儀，采用MTS法檢測細胞存活率;使用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，BD caliber流式細胞儀檢測細胞凋亡率;使用上海康成生物公司生產(chǎn)的HRP標記的GAPDH優(yōu)質(zhì)內(nèi)參，cell signal technology生產(chǎn)的一抗(phospho-Akt)，southern biotech生產(chǎn)的二抗(Goat Anti-Rabbi

17、t IgG，采用Western Blot檢測Akt蛋白表達;使用TOYOBO公司生產(chǎn)的SYBR Green PCRMaster Mix定量PCR用酶，ABI PRISM(@)7300 SequeNC siRNAe Detection System的定量PCR儀，采用Q-PCR檢測Bad mRNA。
　　 結(jié)果：
　　 缺氧復(fù)氧組較正常對照組凋亡率明顯增加，存活率降低;缺氧后適應(yīng)組較缺氧復(fù)氧組凋亡率降低，存活率增加;缺氧后

18、適應(yīng)+CT1組較缺氧后適應(yīng)組凋亡率進一步降低，存活率進一步增加。Akt磷酸化蛋白水平明顯升高，Bad mRNA表達下調(diào)。加入Akt阻滯劑(A6730)后，缺氧后適應(yīng)+CT1+Akt抑制劑組較缺氧后適應(yīng)+CT1組凋亡率增加，存活率降低，Akt磷酸化蛋白水平下降，Bad mRNA表達升高，缺氧后適應(yīng)+CT1+二甲基亞砜組較缺氧后適應(yīng)+CT1+Akt抑制劑組凋亡率降低，存活率增加，Akt磷酸化蛋白水平明顯升高，Bad mRNA表達下調(diào)，基本與