利用siRNA抑制VEGF-C抗乳腺癌血管形成的研究.pdf

1、目的：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(vascular endothelial growth factor-C VEGF-C)通過(guò)對(duì)腫瘤間質(zhì)新生淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移的調(diào)控，促進(jìn)腫瘤的淋巴管形成。本研究應(yīng)用經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的小干擾RNA(smallinterference RNA，siRNA)在體內(nèi)外抑制VEGF-C的表達(dá)，探討化學(xué)修飾的siRNA介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)對(duì)乳腺癌基因治療的可行性和特異性。 方法：設(shè)計(jì)針對(duì)VEGF-C基因的小干擾

2、RNA，選用陽(yáng)離子脂質(zhì)體jetPEITM2000作為轉(zhuǎn)染試劑。在體外實(shí)驗(yàn)中，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將雙鏈siRNA導(dǎo)入人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞，設(shè)立空白對(duì)照組（轉(zhuǎn)染試劑中只加無(wú)血清無(wú)抗生素培養(yǎng)基）、脂質(zhì)體組（轉(zhuǎn)染試劑中只加jetPEITM20000.5μl/孔）、3個(gè)siRNA濃度梯度組(50、100、200 nmol/L)及siRNA SCR組(100 nmol/L)，用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT比色法)檢測(cè)siRNA對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影

3、響。通過(guò)Hoechst33258染色觀察MCF-7細(xì)胞的凋亡，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后VEGF-C基因和p53基因的mRNA表達(dá)水平，蛋白印記試驗(yàn)(Western blot)檢測(cè)VEGF-C基因和p53基因的蛋白水平表達(dá)變化：在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，于雌裸鼠皮下種植MCF-7細(xì)胞制備動(dòng)物模型，將成瘤陽(yáng)性的裸小鼠隨機(jī)分為VEGF-C siRNA處理組、脂質(zhì)體組和對(duì)照組，每組5只。VEGF-C siRNA處理組腫瘤局部注射V

4、EGF-C siRNA1 mg/kg與jetPEITM混合物，脂質(zhì)體組腫瘤局部注射jetPEITM2000（濃度與上述處理組相同）和PBS，對(duì)照組僅注射PBS。每3d注射1次，連續(xù)8次。22d后拉頸處死全部動(dòng)物，取腫瘤，采用半定量RT-PCR分析VEGF mRNA水平，Western blotting檢測(cè)VEGF-C蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：VEGF-C siRNA轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細(xì)胞后，VEGF-C siRN

5、A三個(gè)濃度組細(xì)胞增長(zhǎng)明顯減慢，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別達(dá)26.12％、50.01％、52.21％，VEGF-C siRNA終濃度為100nmol/L時(shí)達(dá)最佳抑制效果(50.01％)。Hoechst33258熒光染色顯示轉(zhuǎn)染siRNA72h后細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)凋亡小體，RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，VEGF-C siRNA處理組明顯下調(diào)了VEGF-C基因與p53基因mRNA的表達(dá)(P<0.01)。Western blot檢測(cè)顯示：與正常對(duì)

6、照組比較，VEGF-C siRNA處理組蛋白VEGF-C和p53的表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.01）。空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組和siRNA SCR組各指標(biāo)無(wú)顯著變化。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：siRNA治療組裸鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好，體重穩(wěn)定，瘤組織的增長(zhǎng)受到明顯抑制，RT-PCR及Western blot均顯示VEGF-C基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），對(duì)照組各指標(biāo)無(wú)顯著變化。 結(jié)論：化學(xué)修飾的siRNA介導(dǎo)的RNAi在體內(nèi)外均能