聯(lián)合應(yīng)用選擇性環(huán)氧合酶-2抑制劑NS-398和脂氧合酶抑制劑NDGA對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG-2增殖及凋亡的影響.pdf

1、肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國常見的惡性腫瘤之一，近二十年來，我國HCC的死亡率增加了41.7％，約占全世界HCC死亡人數(shù)的42％。目前，手術(shù)切除仍是治療HCC的最佳手段，但本病起病隱匿，病情發(fā)展迅速，大多數(shù)患者就診時(shí)已發(fā)展到中晚期，失去了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，患者5年生存率低于％。環(huán)氧合酶(cylooxygenases,COX)和脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)是體內(nèi)催化花生四烯酸

2、(arachidonic acid，AA)代謝的兩個(gè)關(guān)鍵酶。細(xì)胞膜上的磷脂在磷脂酶A2作用下釋放出AA，AA經(jīng)COX和LOX兩條通路代謝產(chǎn)生一系列的生物活性物質(zhì)，如前列腺素(PG)、血栓烷素A2(TXA2)、羥基廿碳四烯酸(HETEs)和白細(xì)胞三烯(LTs)等。通過這些活性物質(zhì)，COX及LOX影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及代謝，進(jìn)而對(duì)包括腫瘤，炎癥在內(nèi)的多種疾病產(chǎn)生作用。NS-398是一種選擇性COX-2抑制劑，與傳統(tǒng)的非甾體類抗炎藥(nonste

3、roidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)不同的是其抑制COX-1的作用非常弱，從而減輕了胃腸道的不良反應(yīng)。目前其已被發(fā)現(xiàn)能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。LOX抑制劑NDGA對(duì)于人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞具有明顯生長抑制作用，同時(shí)還可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，引起細(xì)胞周期被阻滯于G1/S期。本研究選用人肝癌細(xì)胞株：HepG2作為研究對(duì)象，探討NS-398和NDGA聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人肝癌細(xì)胞的增殖抑制和

4、誘導(dǎo)凋亡作用及對(duì)bcl-2mRNA表達(dá)的影響，為將NS-398和NDGA聯(lián)合應(yīng)用于HCC的治療提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的： 探討單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用選擇性環(huán)氧合酶-2抑制劑(cyclooxygenase-2 selectiveinhibitor)NS-398和脂氧合酶抑制劑(lipoxygenase inhibitor)NDGA對(duì)于人肝癌細(xì)胞株HepG2的增殖、凋亡和對(duì)bcl-2mRNA表達(dá)的影響。 方法： (

5、1)采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用NS-398和NDGA對(duì)于人肝癌細(xì)胞株HepG2的增殖抑制作用并應(yīng)用金正均法判斷兩藥的相互作用。 (2)采用DNA末端原位標(biāo)記染色法(TUNEL法)觀察藥物作用后人肝癌細(xì)胞株HepG2的形態(tài)學(xué)改變并計(jì)算凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)。 (3)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)藥物作用后對(duì)于人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞凋亡率。 (4)采用RT-PCR檢測(cè)藥物作

6、用后人肝癌細(xì)胞株HepG2中bcl-2 mRNA的表達(dá)。 結(jié)果： (1)MTT結(jié)果顯示NS-398(20～160μmol/L)或NDGA(25~200μmol/L)單獨(dú)應(yīng)用對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2均有增殖抑制作用，藥物濃度越高，抑制作用越強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。系列濃度NS-398或NDGA作用于細(xì)胞24h、48h、72h后觀察細(xì)胞的生長情況，結(jié)果顯示NS-398或NDGA作用時(shí)間越長，對(duì)上述細(xì)胞的抑制作用越強(qiáng)，呈明

7、顯的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。依據(jù)金正均法NS-398在20～160μmol·L-1濃度范圍內(nèi)與NDGA 25~100 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)及NS-398 20 μmol·L-1與NDGA 200 μmol·L-1聯(lián)合應(yīng)用顯示出協(xié)同作用(q>1.15)，余濃度聯(lián)合應(yīng)用顯示相加作用(0.85

8、S-398(160μmol/L)和NDGA(200μmol/L)單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用48h后均可誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株HepG2發(fā)生凋亡，凋亡細(xì)胞胞核成棕色，核固縮，大小不一；非凋亡細(xì)胞細(xì)胞核淡藍(lán)紫色，核形態(tài)大小較一致。聯(lián)合用藥組較各單獨(dú)用藥組及對(duì)照組凋亡指數(shù)增高。 (3)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示經(jīng)NS-398(160μmol/L)和NDGA(200μmol/L)單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用48h后均可誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株HepG2發(fā)生凋亡，在DNA直方圖上G0/

9、G1期前可見亞G1峰即凋亡峰，NS-398與NDGA聯(lián)合應(yīng)用48h后凋亡率明顯高于各單獨(dú)用藥組，提示兩藥合用對(duì)誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株HepG2凋亡有協(xié)同作用。 (4)RT-PCR檢測(cè)bcl-2 mRNA的結(jié)果顯示NS-398(160μmol/L)或NDGA(200μmol/L)單獨(dú)和聯(lián)合用藥48h后HepG2細(xì)胞bcl-2 mRNA的表達(dá)均降低，兩藥聯(lián)合用藥組人肝癌HepG2細(xì)胞bcl-2 mRNA表達(dá)明顯低于NS-398或NDGA單

10、獨(dú)用藥組，差異具有顯著性(P<0.01)。 結(jié)論： (1)單獨(dú)應(yīng)用NS-398或NDGA對(duì)于人肝癌細(xì)胞株HepG2均有增殖抑制作用，且呈劑量和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。NS-398和NDGA聯(lián)合用藥對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2的增殖抑制具有協(xié)同作用。 (2)單獨(dú)應(yīng)用NS-398或NDGA對(duì)于人肝癌細(xì)胞株HepG2均有誘導(dǎo)凋亡作用；NS-398和NDGA聯(lián)合用藥對(duì)于人肝癌細(xì)胞株HepG2有協(xié)同誘導(dǎo)凋亡作用，并可能與抑制bcl-2-