mic2-CD99上調(diào)誘導(dǎo)L428 H-RS細(xì)胞轉(zhuǎn)型的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 1．明確mic2/CD99在人HL細(xì)胞株和cHL組織中H/RS細(xì)胞的表達(dá)情況。 2．構(gòu)建mic2/CD99基因的真核表達(dá)載體。 3．構(gòu)建L428-CD99細(xì)胞模型并進(jìn)行初步鑒定。 方法： 1．設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，采用分子原位雜交和免疫組化技術(shù)檢測(cè)mic2/CD99在HL細(xì)胞株L428中及人15例cHL組織中H/RS細(xì)胞的表達(dá)。 2．設(shè)計(jì)mic2/CD99基因特異性PCR引物，采用RT

2、-PCR法從T淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞總RNA中獲取mic2/CD99基因全長(zhǎng)cDNA，克隆入T載體，篩選陽性克隆、酶切鑒定并經(jīng)序列測(cè)定；設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)的PCR引物，PCR獲取mic2/CD99基因表達(dá)編碼區(qū)，用限制性內(nèi)切酶Kpn Ⅰ和Apa Ⅰ雙酶切取所需目的片段，利用分子克隆技術(shù)與pcDNA3.1(+)質(zhì)粒重組，對(duì)產(chǎn)生的重組子進(jìn)行PCR、雙酶切鑒定，并經(jīng)過測(cè)序證實(shí)。 3．經(jīng)過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和G418克隆篩選，上調(diào)L428細(xì)胞m

3、ic2/CD99基因，用軟瓊脂克隆形成法和96孔板有限稀釋法篩選L428-CD99單克隆，并擴(kuò)增培養(yǎng)該克隆，建立細(xì)胞模型，命名為L(zhǎng)428-CD99。 4．應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)L428-CD99細(xì)胞基因組與pcDNA3.1(+)-CD99載體整合情況；光鏡下觀察L428-CD99細(xì)胞形態(tài)特征；光鏡下測(cè)試網(wǎng)格計(jì)數(shù)法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)由L428的H/RS細(xì)胞(直徑=25um)轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)428-CD99細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率； 免疫組化檢測(cè)CD99

4、、CD30在L428-CD99和L428細(xì)胞中的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)L428-CD99、L428細(xì)胞及人B淋巴瘤細(xì)胞株BJAB中CD30和CD15的表達(dá)。 結(jié)果： 1．人HL細(xì)胞株和cHL組織中H/RS細(xì)胞mic2、CD99基因檢測(cè)人HL細(xì)胞株和cHL組織H/RS細(xì)胞的mic2/CD99基因mRNA及蛋白(14/15，93.3％)呈陰性表達(dá)。 2．mic2/CD99真核表達(dá)載體構(gòu)建RT-PCR法獲得mic2/CD

5、99基因全長(zhǎng)eDNA序列，DNA測(cè)序的結(jié)果與GenBank提供的已知序列(NM-002414)完全一致；重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-CD99中的插入片段經(jīng)DNA測(cè)序后與GenBank中mic2/CD99基因相應(yīng)序列比較100％同源。成功構(gòu)建了pcDNA3.1(+)-CD99真核表達(dá)載體。 3．L428-CD99細(xì)胞模型的建立及初步鑒定利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染L428細(xì)胞，經(jīng)G418克隆篩選10d后停藥，復(fù)蘇培養(yǎng)10d后形成L428-C

6、D99單克隆，擴(kuò)增培養(yǎng)該克隆6-7d，出現(xiàn)明顯形態(tài)改變，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞核變小，本研究將轉(zhuǎn)型的細(xì)胞命名為L(zhǎng)428-CD99細(xì)胞。定期收獲實(shí)驗(yàn)組(L428-CD99)和對(duì)照組(L428)細(xì)胞，檢測(cè)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒與細(xì)胞基因組整合情況，電泳可見基因片段558bp，證實(shí)載體已轉(zhuǎn)入細(xì)胞，并整合到基因組。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，接種96孔板48h后，對(duì)照組(L428)中的大細(xì)胞或H/RS樣細(xì)胞(直徑=2μm)比例為(10.17±0.0194)％，實(shí)驗(yàn)組(L4

7、28-CD99)細(xì)胞中H/RS樣細(xì)胞的比例為(3.33±0.0103)％，接種96孔板96h后，L428細(xì)胞中的大細(xì)胞比例為(11.50±0.0339)％，L428-CD99細(xì)胞中H/RS樣細(xì)胞比例為(3.67±0.0126)％。繪制兩組細(xì)胞中H/RS細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，L428-CD99細(xì)胞中H/RS樣細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞L428相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，大H/RS樣細(xì)胞在L428細(xì)胞明顯高于L428-CD99細(xì)胞。細(xì)胞片免

8、疫組化實(shí)驗(yàn)顯示，CD30蛋白在L428的H/RS細(xì)胞胞膜中呈陽性表達(dá)，而在L428-CD99細(xì)胞的H/RS細(xì)胞中呈陰性表達(dá)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)L428-CD99、L428、BJAB細(xì)胞株CD30和CD15的表達(dá)，陽性表達(dá)率分別為3.17％、55.24％、4.64％；檢測(cè)CD15的表達(dá)，陽性表達(dá)率分別為4.15％、12.01％、3.44％。 結(jié)論： 1．人HL細(xì)胞株L428和eHL組織H/RS細(xì)胞中mic2/CD99在mRNA

9、水平和蛋白水平均為低表達(dá)，CD99低表達(dá)或表達(dá)缺失或可作為H/RS細(xì)胞表型的一個(gè)特點(diǎn)。 2．上調(diào)人HL細(xì)胞株L428細(xì)胞mic2/CD99表達(dá)，可以誘導(dǎo)H/RS細(xì)胞形態(tài)、免疫表型和生物學(xué)特性發(fā)生改變或消失。創(chuàng)新之處1．證實(shí)人HL細(xì)胞株L428和cHL組織中H/RS細(xì)胞mic2/CD99的mRNA和蛋白呈低表達(dá)，提出CD99低表達(dá)或表達(dá)缺失或可作為H/RS細(xì)胞表型的一個(gè)特點(diǎn)。 3．構(gòu)建了L428-CD99細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)mi