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文檔簡(jiǎn)介
1、研究背景和目的:
霍奇金淋巴瘤(Hodgkinlymphoma,HL)是惡性淋巴瘤的一大類型,具有特征性的腫瘤細(xì)胞H/RS(Hodgkin/Reed-Steinberg)細(xì)胞,但H/RS細(xì)胞一般僅占腫瘤組織的極少部分(<1%),其余是大量以T淋巴細(xì)胞為主的炎性反應(yīng)背景細(xì)胞,且經(jīng)常發(fā)生變異,造成診斷上的困難。要把握H/RS的本質(zhì),就必須清楚H/RS細(xì)胞是如何發(fā)生、發(fā)展,與背景細(xì)胞之間究竟存在怎樣復(fù)雜的相互關(guān)系,而要從根本上探
2、究這些問(wèn)題,迫切需要類似人HL病理特征的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。目前雖然存在諸多人源性H/RS細(xì)胞株,但成瘤實(shí)驗(yàn)罕見(jiàn)報(bào)道,因?yàn)檠芯匡@示運(yùn)用人H/RS細(xì)胞株時(shí)往往需要免疫嚴(yán)重缺陷的實(shí)驗(yàn)鼠如SCID、BNX或NOG鼠才能成瘤,但是越是免疫缺陷則越不能反映該腫瘤具有豐富免疫背景及炎癥特性。因此構(gòu)建鼠源性的H/RS細(xì)胞來(lái)構(gòu)建鼠源性的動(dòng)物模型成為研究的一個(gè)長(zhǎng)期設(shè)想。
Küppers等研究者發(fā)現(xiàn)H/RS細(xì)胞來(lái)源于生發(fā)中心的殘疾B細(xì)胞,認(rèn)為生發(fā)中
3、心B細(xì)胞在成熟過(guò)程中,一部分細(xì)胞經(jīng)歷了有利的突變選擇,被T輔助及濾泡樹(shù)突狀細(xì)胞所選擇,經(jīng)過(guò)反復(fù)的增生、突變和選擇,陽(yáng)性選擇細(xì)胞分化為漿細(xì)胞及記憶B細(xì)胞;而另一部分GCB細(xì)胞經(jīng)過(guò)不利的突變,如反義突變、自身反應(yīng)性的獲得等成為功能上殘缺的所謂前凋亡細(xì)胞,并經(jīng)歷了程序性細(xì)胞死亡。一些殘缺的前凋亡細(xì)胞丟失了被抗原選擇的能力,從而沒(méi)有經(jīng)歷正常的凋亡過(guò)程,成為H/RS前體細(xì)胞。H/RS細(xì)胞在克隆過(guò)程中其B細(xì)胞表面標(biāo)志部分或全部消失,出現(xiàn)CD15、C
4、D30特征性抗原標(biāo)記物,成為H/RS細(xì)胞的生物學(xué)特性之一。由于H/RS細(xì)胞免疫表型及受體的改變,使其逃避免疫監(jiān)視和細(xì)胞凋亡而得以生存及克隆性增殖。
人CD99是一個(gè)糖基化跨膜蛋白,研究發(fā)現(xiàn)CD99的下調(diào)與人H/RS細(xì)胞的形成有關(guān)。本研究組前期通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CD99基因表達(dá)陰性的HL細(xì)胞株L428,篩選穩(wěn)定表達(dá)CD99的L428-CD99細(xì)胞亞系,初步證實(shí)L428-CD99細(xì)胞亞系重現(xiàn)部分B細(xì)胞特征;同時(shí)發(fā)現(xiàn)鼠源性CD99(
5、mouseCD99antigen-like2,mCD99L2)和CD99高度同源,通過(guò)慢病毒ShRNA質(zhì)粒LV-mCD99L2轉(zhuǎn)染內(nèi)源性mCD99L2基因表達(dá)陽(yáng)性的B淋巴瘤細(xì)胞株A20,篩選穩(wěn)定表達(dá)干擾質(zhì)粒的LV-mCD99L2-A20細(xì)胞亞系,初步證實(shí)有些LV-mCD99L2-A20細(xì)胞和人H/RS細(xì)胞有相似特征。
本研究擬在構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人CD99基因的L428亞系和穩(wěn)定干擾鼠CD99基因的鼠B淋巴瘤A20細(xì)胞亞系的基礎(chǔ)
6、上,利用熒光差異凝膠雙向電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)分別比較兩種處理前后的細(xì)胞株蛋白表達(dá)差異,分離與鑒定與人、鼠CD99相互作用的靶蛋白,通過(guò)生物信息學(xué)研究分析方法得到的人、鼠兩組數(shù)據(jù),篩選出在細(xì)胞轉(zhuǎn)化中起重要作用的蛋白,分析驗(yàn)證其功能及可能涉及的信號(hào)通路,為進(jìn)一步闡明mCD99L2相互作用蛋白在構(gòu)建H/RS細(xì)胞模型和類人HL動(dòng)物模型中的作用和意義提供理論依據(jù)。
研究?jī)?nèi)容與方法:
一、L428-CD99和LV-mCD9
7、9L2-A20細(xì)胞亞系的鑒定及分析
1.L428-CD99細(xì)胞亞系的鑒定
對(duì)前期構(gòu)建的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)CD99基因的L428-CD99克隆株反復(fù)傳代培養(yǎng),利用RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR、Westernblot檢測(cè)CD99mRNA和蛋白表達(dá);通過(guò)光鏡觀察、細(xì)胞計(jì)數(shù)和鬼筆環(huán)肽染色檢測(cè)CD99基因過(guò)表達(dá)對(duì)L428細(xì)胞形態(tài)大小以及細(xì)胞骨架蛋白的影響;利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CD99基因過(guò)表達(dá)對(duì)L428細(xì)胞增殖能力的影
8、響;利用免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞檢測(cè)相關(guān)抗原標(biāo)記分析CD99基因上調(diào)對(duì)L428細(xì)胞分化相關(guān)蛋白的影響。
2.LV-mCD99L2-A20細(xì)胞亞系的鑒定
對(duì)前期篩選出的穩(wěn)定干擾mCD99L2基因表達(dá)的LV-mCD99L2-A20細(xì)胞株反復(fù)傳代培養(yǎng),利用載體上通用引物進(jìn)行PCR檢測(cè)干擾載體整合至LV-mCD99L2-A20細(xì)胞情況;利用RT-PCR檢測(cè)目的基因片段mCD99L2的mRNA表達(dá),通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-
9、PCR檢測(cè)mCD99L2基因的干擾效率;鏡下觀察觀察mCD99L2干擾對(duì)A20細(xì)胞形態(tài)大小的影響,利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mCD99L2干擾對(duì)A20細(xì)胞增殖能力的影響。
二、CD99+/mCD99L2-調(diào)控H/RS細(xì)胞與B淋巴瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
運(yùn)用熒光差異雙向凝膠電泳技術(shù)分別對(duì)人鼠兩組轉(zhuǎn)化細(xì)胞(人源性L428-CD99細(xì)胞/空載體轉(zhuǎn)染的L428-CTR細(xì)胞和鼠源性LV-mCD99L2-A20和空載體轉(zhuǎn)染的
10、LV-Gus-A20細(xì)胞)進(jìn)行蛋白分離得到差異蛋白凝膠電泳圖,結(jié)合軟件分析和手工篩選,與制備膠匹配后,挖取了差異蛋白質(zhì)點(diǎn),采用靈敏且高通量的肽質(zhì)量指紋圖譜蛋白質(zhì)鑒定方法鑒定差異蛋白,進(jìn)一步采用GOfact開(kāi)放軟件進(jìn)行在線聚類分析(http://www.hupo.org.cn/gofact),對(duì)所得差異蛋白所參與的生物過(guò)程、所參與構(gòu)成的細(xì)胞組件、所介導(dǎo)的分子功能進(jìn)行注釋,分析和細(xì)胞轉(zhuǎn)化相關(guān)的蛋白。
三、CD99+/mCD99
11、L2-調(diào)控H/RS細(xì)胞與B淋巴瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的差異蛋白篩選及初步驗(yàn)證
1.篩選差異蛋白并分析
通過(guò)生物信息學(xué)檢索預(yù)測(cè)CD99和mCD99L2相互作用的蛋白,結(jié)合雙向熒光凝膠電泳和質(zhì)譜分析得到的人鼠兩組差異蛋白,篩選分析人CD99+/鼠mCD99L2-調(diào)控H/RS細(xì)胞與B淋巴瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的差異蛋白。
2.篩選蛋白在人細(xì)胞、組織上的表達(dá)驗(yàn)證
利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)、Wes
12、ternblot和免疫熒光共聚焦檢測(cè)篩選差異蛋白在人H/RS細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞(L428-CD99和L428-CTR)和病理組織中的mRNA和蛋白表達(dá)。
3.篩選蛋白在鼠源性細(xì)胞上的表達(dá)驗(yàn)證
利用免疫細(xì)胞化學(xué)、Westernblot檢測(cè)篩選差異蛋白在LV-mCD99L2-A20和LV-Gus-A20細(xì)胞中表達(dá)。
四、差異蛋白Septin-2在L428細(xì)胞和B淋巴瘤細(xì)胞初步功能驗(yàn)證及相關(guān)信號(hào)通路分析
13、r> 1、Septin-2蛋白與H/RS細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞調(diào)控因子的關(guān)系
信息學(xué)分析、westernblot檢測(cè)驗(yàn)證Septin-2與調(diào)控因子nf-kappaB和c-Myb的關(guān)系。
2、Septin-2在H/RS細(xì)胞和B淋巴瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化中初步功能驗(yàn)證
瞬時(shí)干擾L428細(xì)胞中Septin-2表達(dá),通過(guò)鏡下觀察、熒光共聚焦檢測(cè)、CCK8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞檢測(cè)Septin-2基因干擾對(duì)L428細(xì)胞形態(tài)、
14、細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞增殖能力和免疫表型的影響。
3、Septin-2在H/RS細(xì)胞和B淋巴瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化中可能參與的信號(hào)通路分析
采用Westernblot檢測(cè)H/RS細(xì)胞L428穩(wěn)定過(guò)表達(dá)CD99基因前后及瞬時(shí)干擾Septin-2基因前后相關(guān)通路蛋白的表達(dá);結(jié)合蛋白組學(xué)分析結(jié)果,通過(guò)生物信息學(xué)和文獻(xiàn)資料分析Septin-2在CD99調(diào)控H/RS細(xì)胞向B淋巴瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化中可能參與的信號(hào)調(diào)控通路。
結(jié)果:
15、
一、L428-CD99和LV-mCD99L2-A20細(xì)胞亞系的鑒定及分析
1.L428-CD99細(xì)胞亞系的鑒定
(1)RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Westernblot檢測(cè)顯示,與空載體組比較,L428-CD99細(xì)胞亞系CD99基因和蛋白表達(dá)均增高。
(2)培養(yǎng)細(xì)胞鏡下形態(tài)觀察、HE染色后計(jì)數(shù),L428-CD99細(xì)胞亞系細(xì)胞體積變小,差異具有顯著性(t=7.131,P
16、=0.018);鬼筆環(huán)肽染色發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,L428-CD99細(xì)胞骨架發(fā)生重建。
(3)MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn),CD99基因過(guò)表達(dá)組較空載體組增殖減慢,差異具有顯著性(F=773.374,P=0.000);
(4)免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn),CD99基因過(guò)表達(dá)后,與對(duì)照組相比,CD30、CD15和MUM1表達(dá)降低,CD10、CD19、CD79α、BCL-6、PAX5和CD38表達(dá)增高,而CD20和CD138的
17、表達(dá)沒(méi)有明顯改變。
2.LV-mCD99L2-A20細(xì)胞亞系的鑒定
(1)PCR檢測(cè)干擾載體穩(wěn)定整合于LV-mCD99L2-A20細(xì)胞基因組,RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)LV-mCD99L2-A20細(xì)胞中目的基因片段mCD99L2的mRNA表達(dá)穩(wěn)定降低,mCD99L2基因的干擾效率約51%。
(2)傳代培養(yǎng)細(xì)胞于倒置顯微鏡下和HE染色發(fā)現(xiàn),LV-mCD99L2-A20細(xì)胞細(xì)胞體積明
18、顯增大,出現(xiàn)類人H/RS細(xì)胞的巨大細(xì)胞;MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mCD99L2干擾使A20細(xì)胞增殖能力下降,差異具有顯著性(F=77.452,P=0.000)。
二、CD99+/mCD99L2-調(diào)控H/RS細(xì)胞與B淋巴瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
1.人源性轉(zhuǎn)化細(xì)胞組熒光差異雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析
人源性轉(zhuǎn)化細(xì)胞組通過(guò)熒光差異雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析得到38個(gè)差異蛋白,與L428-CD99細(xì)胞而言正相關(guān)的蛋白
19、21個(gè),負(fù)相關(guān)的蛋白17個(gè)。其中RhoGDP-dissociationinhibitor2(GDIR2)和Septin-2(SEPT2)參與細(xì)胞骨架;DNAmismatchrepairproteinMsh2(MSH2),Hematopoieticlineagecell-specificprotein(HS1)參與細(xì)胞分化;RhoGDP-dissociationinhibitor2(GDIR2)、ProstaglandinEsynthas
20、e3(TEBP)、Prohibitin(PHB)、Hematopoieticlineagecell-specificprotein(HS1)、Sorcin(SORCN)和GEM-interactingprotein(GMIP)參與信號(hào)通路;Prohibitin(PHB)、Heatshockproteinbeta-1(HSPB1)和Hematopoieticlineagecell-specificprotein(HS1)參與調(diào)節(jié)基因表達(dá)。
21、
2.鼠源性轉(zhuǎn)化細(xì)胞組熒光差異雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析
鼠源性轉(zhuǎn)化細(xì)胞組通過(guò)熒光差異雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析得到41個(gè)差異蛋白,其中與LV-mCD99L2-A20細(xì)胞而言正相關(guān)的蛋白21個(gè),負(fù)相關(guān)的蛋白20個(gè)。其中參與細(xì)胞骨架的蛋白有Actin,cytoplasmic1(ACTB)、Septin-2(SEPT2)、PDZandLIMdomainprotein1(PDLI1),Stathmin(STMN1);參與細(xì)
22、胞分化的蛋白有stathmin(STMN1)、ADP-ribosylationfactor-likeprotein6(ARL6);參與信號(hào)通路的蛋白有RanGTPase-activatingprotein1(RAGP1)、ADP-ribosylationfactor-likeprotein6(ARL6);參與調(diào)節(jié)基因表達(dá)的蛋白有Eukaryotictranslationinitiationfactor4E(IF4E)、Nucleopho
23、smin(NPM)、60kDaheatshockprotein,mitochondrial(CH60)、PDZandLIMdomainprotein1(PDLI1)、Hypermethylatedincancer2protein(HIC2)、Poly(U)-binding-splicingfactorPUF60(GCP60)等。
三、CD99+/mCD99L2-調(diào)控H/RS細(xì)胞與B淋巴瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化差異蛋白篩選及驗(yàn)證
24、 1.通過(guò)生物信息學(xué)檢索和人鼠兩組轉(zhuǎn)化細(xì)胞差異蛋白的分析比較,選取骨架蛋白Septin-2和Stathmin作為驗(yàn)證的目標(biāo)蛋白。
2.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR、免疫細(xì)胞和細(xì)胞化學(xué)、Westernblot和熒光共聚焦檢測(cè)顯示Septin-2和Stathmin的mRNA水平、蛋白水平在人轉(zhuǎn)化細(xì)胞組L428和L428-CD99中存在差異表達(dá),蛋白水平在組織標(biāo)本中也存在差異,Septin-2和CD99表達(dá)負(fù)相關(guān),Stathmi
25、n和CD99表達(dá)正相關(guān)。
3.免疫細(xì)胞化學(xué)、Westernblot檢測(cè)顯示Septin-2和Stathmin在鼠源性轉(zhuǎn)化細(xì)胞A20和LV-mCD99L2-A20中存在差異表達(dá),與人源性轉(zhuǎn)化細(xì)胞上表達(dá)一致。
四、差異蛋白Septin-2在L428細(xì)胞和B淋巴瘤細(xì)胞初步功能驗(yàn)證及相關(guān)信號(hào)通路分析
1.Septin-2上游調(diào)控因子NF-kappaB1、c-Myb和XBP-1也是促進(jìn)H/RS細(xì)胞形成和B
26、細(xì)胞分化的調(diào)控因子。Westernblot檢測(cè)顯示NF-kappaB1和c-Myb參與H/RS細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,Septin-2的表達(dá)受nf-kappaB、c-Myb調(diào)控,與nf-kappaB表達(dá)呈正相關(guān),與c-Myb表達(dá)呈負(fù)相關(guān);nf-kappaB和c-Myb不受Septin-2的調(diào)控。
2.倒置顯微鏡下連續(xù)觀察和熒光共聚焦檢測(cè)顯示L428瞬時(shí)干擾SEPT2后細(xì)胞骨架發(fā)生重建,細(xì)胞偽足狀突起消失。
3
27、.CCK8試驗(yàn)顯示與空載體組L428-cn細(xì)胞相比,L428-sisept2細(xì)胞株生長(zhǎng)較緩慢,差異具有顯著性(F=204.927,P=0.000)。
4.流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示L428細(xì)胞瞬時(shí)干擾Septin-2后細(xì)胞的部分抗原標(biāo)記出現(xiàn)了小幅改變,H/RS細(xì)胞特征性抗原標(biāo)記CD30和CD15表達(dá)下降,B細(xì)胞抗原標(biāo)記CD19表達(dá)上升,生發(fā)中心標(biāo)記CD10和早期漿細(xì)胞標(biāo)記CD38表達(dá)也有上升。
5.Westernb
28、lot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),干擾L428中Septin-2和過(guò)表達(dá)L428中CD99表達(dá),RhoA蛋白表達(dá)都明顯降低;結(jié)合RhoGDI2、HS1、Stathmin等差異蛋白和信息學(xué)檢索,提出CD99調(diào)控H/RS細(xì)胞和B淋巴瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中,可能通過(guò)上調(diào)RhoGDI2來(lái)抑制RhoFamilyGTPases信號(hào)通路中的RhoGTP酶,主要是抑制了RhoA活性,從而抑制細(xì)胞骨架GTP結(jié)合蛋白Septin-2的表達(dá),促使骨架重建并抑制了細(xì)胞的增殖活性;同時(shí)
29、Septin-2也能通過(guò)調(diào)節(jié)RhoA蛋白參與B細(xì)胞受體通路,和HS1共同平衡轉(zhuǎn)化細(xì)胞的骨架重組,參與調(diào)節(jié)B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和B細(xì)胞抗原的形成分化。另一骨架蛋白Stathmin可能起到協(xié)同改變細(xì)胞骨架和形態(tài)作用。
結(jié)論:
1.前期構(gòu)建L428-CD99和LV-mCD99L2-A20細(xì)胞亞系反復(fù)傳代培養(yǎng)并驗(yàn)證CD99+/mCD99L2-調(diào)控了H/RS細(xì)胞與B淋巴瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化;
2.人H/RS細(xì)胞株L42
30、8過(guò)表達(dá)CD99后得到38個(gè)差異蛋白,21個(gè)表達(dá)上調(diào),17個(gè)表達(dá)下調(diào);鼠源性B淋巴瘤細(xì)胞株A20敲低mCD99L2表達(dá)后得到41個(gè)差異蛋白,21個(gè)表達(dá)上調(diào),20個(gè)表達(dá)下調(diào);部分蛋白參與細(xì)胞分化、信號(hào)通路、骨架改變和基因表達(dá)調(diào)節(jié)等功能,和細(xì)胞轉(zhuǎn)化密切相關(guān);
3.骨架蛋白Septin-2和Stathmin在人鼠兩組轉(zhuǎn)化細(xì)胞中皆存在差異表達(dá),Septin-2與CD99表達(dá)負(fù)相關(guān),Stathmin與CD99表達(dá)正相關(guān);
31、 4.初步驗(yàn)證了Septin-2在人H/RS細(xì)胞轉(zhuǎn)化中通過(guò)骨架重建參與細(xì)胞形態(tài)改變,降低細(xì)胞增殖活性,參與H/RS細(xì)胞向B淋巴瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中的抗原分化;分析其可能主要通過(guò)RhoFamilyGTPases信號(hào)通路和B細(xì)胞受體的信號(hào)通路發(fā)揮作用。
創(chuàng)新之處
1.本研究通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選CD99+/mCD99L2-調(diào)控了H/RS細(xì)胞與B淋巴瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的差異蛋白,分析出一批和轉(zhuǎn)化密切相關(guān)的蛋白;
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