A20-LV-mCD99L2-A20鼠淋巴瘤動物模型的構(gòu)建與HL.pdf

1、目的: 1、鑒定低表達mCD99L2的LV-mCD99L2-A20細胞亞系，以探究mCD99L2基因在HL的H/RS細胞形成中的作用，并為后續(xù)模型動物的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。 2、鼠源性B淋巴瘤細胞株A20以不同方式接種同源BALB/c小鼠，構(gòu)建有免疫功能的鼠B淋巴瘤動物模型，探討不同造模方式的優(yōu)劣，為本研究后續(xù)工作奠定基礎(chǔ)，并為B淋巴瘤相關(guān)研究提供適合的實驗平臺。 3、將LV-mCD99L2-A20細胞亞系接種BALB

2、/c小鼠，進行成瘤情況觀察、病理形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定和免疫標記的檢測，探討成瘤特點、成瘤組織病變特征與A20動物模型之間的差異及與HL之間的關(guān)系。 4、借助生物信息學(xué)軟件對HL與細胞因子相關(guān)性進行檢索和分析。利用蛋白芯片初步檢測A20/LV-mCD99L2-A20細胞和BALB/c成瘤組織中細胞因子的表達、及差異，尋找LV-mCD99L2-A20細胞模型、動物模型與構(gòu)建類人HL動物模型之間關(guān)系的相關(guān)依據(jù)。 方法:

3、 1、LV-mCD99L2-A20細胞亞系的鑒定對前期構(gòu)建的慢病毒質(zhì)粒穩(wěn)定干擾的LV-mCD99L2-A20克隆株進行體外培養(yǎng)，倒置顯微鏡、HE染色觀察LV-mCD99L2-A20細胞的形態(tài)變化并進行計數(shù)，隨機選擇多代細胞進行DNA-PCR檢測ShRNA干擾載體的整合，RT-PCR及熒光定量PCR檢測目的基因mCD99L2的表達水平，免疫熒光觀察mCD30分子標記，MTT法觀察細胞體外增殖能力，流式細胞儀檢測細胞周期及細胞的免疫表

4、型(CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD30)。 2、五種方式構(gòu)建有免疫功能A20鼠B淋巴瘤動物模型將鼠源性B細胞淋巴瘤細胞株A20經(jīng)皮下接種、尾靜脈注射、脾臟注射、腹腔注射于同源BALB/c小鼠和A20接種裸鼠成瘤組織移植BALB/c小鼠，觀察動物成瘤時間、成瘤率、皮下腫瘤生長速度、內(nèi)臟成瘤播散部位；取動物臟器行石蠟包埋、制備病理切片、HE染色觀察病理學(xué)形態(tài)；運用流式細胞儀檢測其瘤組織細胞懸液中CD3、CD4、CD

5、8、CD19、CD30的表達；流式細胞儀檢測正常BALB/c小鼠、接種成瘤小鼠和未成瘤小鼠外周血中淋巴細胞亞群的比例。 3、LV-mCD99L2-A20鼠淋巴瘤動物模型的構(gòu)建將經(jīng)過鑒定的低表達mCD99L2基因的LV-mCD99L2-A20細胞亞系經(jīng)皮下接種、尾靜脈注射和裸鼠成瘤組織塊移植的方法接種BALB/c小鼠，觀察動物成瘤情況；取動物臟器行石蠟包埋、病理切片、HE染色觀察病理學(xué)形態(tài)；計數(shù)成瘤切片中H/RS樣細胞；免疫熒光檢

6、測瘤組織mCD30分子標記；運用流式細胞儀檢測其瘤組織細胞懸液中CD3、CD4、CD8、CD19、CD30的表達。腫瘤組織進行原代培養(yǎng)，DNA-PCR檢測載體的整合，RT-PCR檢測mCD99L2基因mRNA水平。流式細胞儀檢測小鼠外周血和脾臟中淋巴細胞亞群的比例。 4、A20/LV-mCD99L2-A20體內(nèi)外細胞因子表達蛋白芯片初步檢測運用生物信息學(xué)軟件GeneClip對HL和62種細胞因子進行文獻檢索，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。運用

7、小鼠細胞因子功能分類蛋白芯片(RayBiotechmousecytokineAntibodyArrays)對A20細胞和LV-mCD99L2-A20細胞、A20細胞BALB/c皮下成瘤組織和LV-mCD99L2-A20細胞BALB/c鼠皮下成瘤組織進行蛋白質(zhì)抽提、蛋白質(zhì)定量，膜封閉和孵育、62種小鼠細胞因子檢測、圖像采集和數(shù)據(jù)分析，對差異細胞因子進行初步分析。 結(jié)果: 1、LV-mCD99L2-A20細胞亞系的鑒定

8、 (1)傳代過程中倒置顯微鏡觀察和HE染色均發(fā)現(xiàn)LV-mCD99L2-A20細胞中存在類似H/RS細胞的大細胞。隨機抽取A、B、C、D代LV-mCD99L2-A20細胞計數(shù)其中的大細胞發(fā)現(xiàn)較A20細胞中的大細胞多，差異有顯著性(P<0.05)。 (2)抽提多代LV-mCD99L2-A20細胞DNA進行PCR均能檢測出ShRNA干擾載體穩(wěn)定整合至A20細胞基因組。 (3)RT-PCR及熒光定量PCR檢測目的基因mCD99

9、L2均較A20細胞呈低水平表達，干擾效率約為50％。 (4)MTT檢測發(fā)現(xiàn)LV-mCD99L2-A20細胞體外增殖能力較對照A20組和空載體組減慢，差異有顯著性(P<0.05)。 (5)流式細胞儀檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)LV-mCD99L2-A20細胞S期比例與A20細胞無顯著性差異(P>0.05)，但是G2期較A20細胞長，差異有顯著性(P<0.05)。 (6)免疫熒光檢測LV-mCD99L2-A20細胞及其中的大細胞

10、CD30呈陽性表達。 (7)LV-mCD99L2-A20細胞的CD3表達(7.47±1.27％)較A20細胞(18.93±3.87％)降低，CD8表達(8.33±3.89％)較A20細胞(18.27±3.45％)降低，CD20表達(13.10±5.16％)較A20細胞(35.33±2.25％)降低，CD30表達(76.0±12.44％)較對照A20細胞(41.70±2.60％)升高，差異有顯著性(n=3，P<0.05)，而CD4

11、、CD19差異不顯著(P>0.05)?？蛰d體組與對照A20細胞CD抗原表達無顯著差異(P>0.05)。 2、五種方式構(gòu)建有免疫功能A20鼠B淋巴瘤動物模型 (1)皮下成瘤：BALB/c小鼠皮下注射2×105組(n=7)未成瘤，2×106組(n=7)、2×107組(n=7)和裸鼠瘤組織移植BALB/c小鼠組(n=7)成瘤率皆為100％，成瘤時間分別為15.29±3.2天、7.0±0.82天、6.29±0.49天。

12、(2)內(nèi)臟成瘤：BALB/c小鼠尾靜脈注射2×106組、2×107組、脾臟注射組、腹腔注射組成瘤率分別為71.4％(5/7)、100％(7/7)、71.4％(5/7)、14.3％(1/7)，成瘤時間分別為76.8±12.0天、26.1±7.99天、32.6±5.99天和27天。尾靜脈成瘤部位播及肝臟、脾臟、胰腺、腎臟、食道、胃、腸、腸系膜、腦、淋巴結(jié)、骨、子宮、肌肉等多臟器和組織。 (3)BALB/c鼠A20成瘤組織鏡下觀察：瘤

13、細胞呈彌漫性分布，大小一致，細胞核大、圓形或不規(guī)則形，核仁明顯，胞質(zhì)中等量、嗜堿性，類似人彌漫大B細胞淋巴瘤。 (4)流式細胞儀檢測成瘤組織細胞懸液(n=8)CD3、CD4、CD8、CD19、CD30的表達陽性細胞比例分別為(％)：49.27±23.75、6.07±3.65、51.2±23.1、67.06±16.39、37.93±17.03。 (5)流式細胞儀檢測外周血淋巴細胞亞群 3、LV-mCD99L2-A2

14、0鼠淋巴瘤動物模型的構(gòu)建 (1)LV-mCD99L2-A20接種后成瘤情況 (2)病理形態(tài)： (3)BALB/c小鼠瘤組織原代培養(yǎng) (4)流式細胞儀檢測外周血淋巴細胞亞群 (5)脾臟淋巴細胞亞群 4、A20/LV-mCD99L2-A20細胞和組織細胞因子表達的蛋白芯片初步檢測 結(jié)論: 1、LV-mCD99L2-A20細胞亞系中存在類似人H/RS細胞形態(tài)的H/RS樣細胞，LV

15、-mCD99L2-A20細胞在增殖能力、細胞周期和免疫表型方面較類似人HL。 2、A20細胞BALB/c小鼠皮下移植瘤模型成瘤時間短、尾靜脈接種形成的血行播散性模型成瘤部位廣泛，均為研究有免疫功能鼠B淋巴瘤適宜的實驗動物模型。 3、LV-mCD99L2-A20細胞較A20細胞在BALB/c鼠難以成瘤，但在成瘤組織中出現(xiàn)似人HL的H/RS樣細胞，伴有一定程度的背景淋巴細胞的浸潤。 4、LV-mCD99L2-A20細

16、胞較A20細胞上調(diào)了一些與報道中的HL或H/RS細胞相關(guān)的細胞因子；LV-mCD99L2-A20細胞與A20細胞在BALB/c小鼠體內(nèi)成瘤組織中細胞因子表達不同。 創(chuàng)新之處： 本研究從體外實驗、裸鼠成瘤實驗和BALB/c鼠成瘤實驗三個水平，從形態(tài)學(xué)、免疫表型、生物學(xué)行為三個主要方面并結(jié)合小鼠免疫功能初步檢測和細胞因子表達蛋白芯片初步檢測，較為系統(tǒng)地對比了A20細胞與LV-mCD99L2-A20細胞在細胞模型之間、動物模型