β-,2-受體的表達(dá)、純化及在快速檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、β2腎上腺素能受體激動(dòng)劑(β2激動(dòng)劑)的非法濫用一直是畜產(chǎn)品安全問(wèn)題的焦點(diǎn)之一。從鹽酸克侖特羅，到萊克多巴胺、齊帕特羅，再到斑布特羅，β2激動(dòng)劑類藥物不斷更新。一種β2激動(dòng)劑類藥物剛得到控制，又會(huì)出現(xiàn)新的藥物，畜牧生產(chǎn)中非法使用β2激動(dòng)劑的現(xiàn)象屢禁不止，因畜產(chǎn)品中殘留而造成消費(fèi)者中毒事件時(shí)有發(fā)生。因此，在監(jiān)控中迫切需要能夠建立β2激動(dòng)劑類藥物多殘留的快速篩選檢測(cè)技術(shù)。 β2激動(dòng)劑的作用機(jī)理是能夠被體內(nèi)的受體蛋白識(shí)別，并引發(fā)一系列

2、生理反應(yīng)，因此β2腎上腺素能受體(β2AR)是一種可以識(shí)別各種β2激動(dòng)劑的蛋白，其與β2激動(dòng)劑的結(jié)合具有特異性和高親和性。 本研究利用本實(shí)驗(yàn)室克隆的大倉(cāng)鼠肺細(xì)胞β2AR基因分別在原核及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行外源表達(dá)并純化，將受體作為識(shí)別所有β2激動(dòng)劑的元件代替抗體，組成受體-β2激動(dòng)劑-酶反應(yīng)系統(tǒng)，為β2激動(dòng)劑的多殘留檢測(cè)提供研究基礎(chǔ)。 通過(guò)大腸桿菌原核細(xì)胞表達(dá)N端融合麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)，C端融合組氨酸標(biāo)簽(6his)

3、的β2AR重組蛋白。構(gòu)建三個(gè)原核表達(dá)載體，pMAL-p2x-β2AR(SX)，pMAL-p2x-β2AR(EX)，pMAL-p2x-β2AR(EX-62)，SX為蛋白酶穩(wěn)定型載體，EX為表達(dá)全長(zhǎng)蛋白，EX-62為截去N端62個(gè)氨基酸的截短蛋白。經(jīng)SDS-PAGE，Westernblotting檢測(cè)融合蛋白得到表達(dá)，將表達(dá)全細(xì)胞經(jīng)放射性配基(125I標(biāo)記的β拮抗劑-氰心得靜，ICYP)檢測(cè)顯示蛋白具有與ICYP結(jié)合的活性，并且這種結(jié)合活性

4、被β2激動(dòng)劑特異性抑制。用檢測(cè)克侖特羅的ELISA試劑盒測(cè)定三種表達(dá)菌液的中帶有的活性蛋白濃度分別為：1.29pmol/L，2.06pmol/L，0.99pmol/L。 為了提高蛋白活性及表達(dá)量，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)融合綠色熒光蛋白(GFP)的重組蛋白。表達(dá)細(xì)胞選擇人胚胎腎細(xì)胞HEK293，分別建立自表達(dá)及誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。構(gòu)建自表達(dá)載體pCDNA3.1＋-β2AR-GFP，N端融合6His標(biāo)簽，C端融合GFP蛋白，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK2

5、93細(xì)胞，可以檢測(cè)到蛋白表達(dá)，融合蛋白具有綠色熒光性，并經(jīng)SDS-PAGE，Westernblotting檢測(cè)有特異性蛋白表達(dá)。但是無(wú)法篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。為了獲得穩(wěn)定表達(dá)β2AR的穩(wěn)定細(xì)胞株，建立四環(huán)素誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)。篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染單克隆細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)后，加入四環(huán)素1μg/mL誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。經(jīng)放射性配基ICYP檢測(cè)顯示其具有與ICYP結(jié)合的活性，并且這種活性被β2激動(dòng)劑特異性抑制。 為了進(jìn)一步提高蛋白的表達(dá)量，經(jīng)過(guò)受體蛋白疏水性分

6、析，根據(jù)蛋白的立體結(jié)構(gòu)，在不影響β2激動(dòng)劑結(jié)合的位點(diǎn)，將疏水氨基酸突變?yōu)橛H水氨基酸。用套疊PCR法進(jìn)行基因突變，構(gòu)建兩個(gè)突變體：突變體一分別對(duì)七個(gè)跨膜域氨基酸進(jìn)行突變，突變體二將二，四，六位氨基酸進(jìn)行突變。構(gòu)建突變?cè)吮磉_(dá)載體pMAL-p2x-β2AR1，pMAL-p2x-β2AR2，并對(duì)蛋白的原核表達(dá)進(jìn)行初步研究。 蛋白純化方面，細(xì)胞經(jīng)多次超速離心后，使用非離子去垢劑將受體蛋白從細(xì)胞膜上解離，原核細(xì)胞表達(dá)蛋白經(jīng)Amalso親和

7、柱純化，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)蛋白經(jīng)鎳柱純化，獲得純化的β2AR蛋白。原核表達(dá)蛋白1L培養(yǎng)基中純化受體量為0.198mg，約占粗膜蛋白的1.67％；哺乳動(dòng)物細(xì)胞從四板細(xì)胞培養(yǎng)瓶(15cm)中純化受體量為0.135mg，約占膜蛋白的3.8％，結(jié)果顯示哺乳動(dòng)物表達(dá)的受體蛋白比例高于大腸桿菌表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE和Westernblotting檢測(cè)，純化后的融合蛋白具有特異結(jié)合抗體的能力。使用斑點(diǎn)-ELISA及斑點(diǎn)-酶聯(lián)配基法，對(duì)純化后β2AR蛋

8、白的配基結(jié)合活性進(jìn)行檢測(cè)，表明粗膜蛋白及純化蛋白保持與克侖特羅等三種β2激動(dòng)劑特異性結(jié)合的活性，且β2AR蛋白與β2激動(dòng)劑結(jié)合量呈現(xiàn)S型濃度依賴曲線。 分別將表達(dá)細(xì)胞的粗膜蛋白和純化β2AR受體包被于96孔聚苯乙烯板，以辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的克侖特羅和游離的克侖特羅，萊克多巴胺及沙丁胺醇構(gòu)成競(jìng)爭(zhēng)型檢測(cè)試劑盒，進(jìn)行β2激動(dòng)劑的多殘留檢測(cè)。隨著游離克侖特羅等β2激動(dòng)劑濃度的增加，HRP的酶促顯色反應(yīng)明顯得到抑制，而對(duì)照組蛋白

9、則無(wú)此反應(yīng)。測(cè)定克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇對(duì)粗膜蛋白及純化蛋白的IC50值，說(shuō)明β2AR受體對(duì)不同β2激動(dòng)劑都有親和性，但是對(duì)克侖特羅的親和力最強(qiáng)。尿樣添加回收實(shí)驗(yàn)中，空白尿樣添加濃度分別為1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL.，同時(shí)用受體包被酶標(biāo)板及ELISA試劑盒檢測(cè)，在受體包被板中添加濃度為1ng/mL時(shí)平均回收率僅達(dá)到40％，添加濃度為高濃度時(shí)(10ng/mL，100ng/mL)回收率達(dá)到70％左右，ELISA試劑