外源性內(nèi)皮祖細(xì)胞在大鼠肝癌模型中的分布及其對(duì)肝癌作用的研究.pdf

1、目的：探索內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）在二乙基亞硝胺（Diethylnitrosamine，DEN）所致大鼠肝癌模型中的分布規(guī)律，并進(jìn)一步探討其在肝癌形成過程中的作用，為肝癌的治療提供新的策略。 方法：①分組：將雄性SD大鼠160只，隨機(jī)分3組：空白對(duì)照組（24只）、模型對(duì)照組（34只）、EPCs實(shí)驗(yàn)組（102只），其中又將EPCs實(shí)驗(yàn)組依據(jù)注射EPCs濃度不同，分為低、中、高

2、3個(gè)濃度組，每組都分成4、6、8周組；空白對(duì)照4、6、8周組均為8只／組；模型對(duì)照與EPCs低、中、高濃度4周組均為10只／組；模型對(duì)照與EPCs低、中、高濃度6、8周組均為12只／組。②造模：取SD大鼠外周血，用Ficoll密度梯度離心法獲取單個(gè)核細(xì)胞，同時(shí)用堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basicity fibroblast growth factor，bFGF）和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑（endothelial cell growth sup

3、plement，ECGS）誘導(dǎo)，Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍祝―il—acLDL）和FITC標(biāo)記的荊豆凝集素—1（FITC—UEA—1）熒光雙染色法鑒定EPCs，免疫組化染色法檢測(cè)EPCs標(biāo)志物CD34、CD133和KDR的表達(dá)，體外經(jīng)DAPI標(biāo)記后，并將EPCs—DAPI制成1×106/mL，2×106/mL，4×106/mL的低、中、高濃度懸液，模型對(duì)照組和EPCs實(shí)驗(yàn)組腹腔注射DEN造模，以0.9%NaCl溶液配置成濃度為40m

4、g/mL（4%）的DEN稀釋液，按每次0.1 mL/100g體重的劑量腹腔注射，每周2次，直至8周，空白對(duì)照組則腹腔注射與DEN等體積的生理鹽水。EPCs實(shí)驗(yàn)組自注射DEN的當(dāng)日開始，經(jīng)尾靜脈注射低、中、高濃度EPCs—DAPI懸液1mL，每周2次，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水1 mL，分別于第四、六、八周末處死，留取標(biāo)本。③指標(biāo)檢測(cè)：肝功能丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（AST）、白蛋白（ALB），肝癌血

5、清學(xué)指標(biāo)甲胎球蛋白（AFP），肝組織病理HE染色，熒光顯微鏡觀察EPCs—DAPI表達(dá)的量及分布的變化，并用Imagepro plus圖像分析軟件對(duì)表達(dá)的陽性區(qū)域面積（Positive area，PA）作半定量分析。④統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，計(jì)量資料采用單因素方差分析，規(guī)定P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：1.動(dòng)物的一般情況：大鼠在給予DEN注射后，均不同程度地出現(xiàn)體毛干枯

6、無澤、活動(dòng)及食量減少，大便溏瀉、小便黃而少等；不同濃度的EPCs實(shí)驗(yàn)組隨造摸時(shí)間的延長(zhǎng)，一般情況更差，活動(dòng)遲緩，體重降低等，尤以EPCs高濃度8周組明顯。2.EPCs的鑒定：倒置顯微鏡下觀察收集的外周血單個(gè)核細(xì)胞，第2天可見少數(shù)細(xì)胞貼壁，呈梭形，形態(tài)較均一，胞核位于細(xì)胞中央。培養(yǎng)4天后可見貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增多，而懸浮細(xì)胞減少。7天后細(xì)胞梭形更為明顯，并逐漸變長(zhǎng)。貼壁細(xì)胞用Dil—acLDL和FITC—UEA—1行熒光化學(xué)染色，Dil—a

7、cLDL標(biāo)記陽性細(xì)胞呈紅色，F(xiàn)ITC—UEA—1標(biāo)記陽性細(xì)胞呈綠色，熒光顯微鏡下雙染色陽性細(xì)胞為橙黃色.貼壁細(xì)胞培養(yǎng)第7天，細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34，CD133和KDR免疫細(xì)胞化學(xué)染色均呈陽性。3.肝組織肉眼及鏡下觀：3.1肉眼及HE染色：①空白對(duì)照組大鼠肝臟外觀呈紅褐色，質(zhì)軟，表面光滑；鏡下肝組織結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)正常。②模型對(duì)照和EPCs低濃度4周組大鼠肝臟外觀多呈暗黃色，質(zhì)地較硬，表面呈小結(jié)節(jié)狀，凸凹不平；鏡下癌細(xì)胞排列呈梁

8、狀或多板狀排列。③EPCs低濃度6、8周組和EPCs中濃度4周組大鼠肝臟外觀呈暗黃綠色，表面見圓形結(jié)節(jié)大小不一，有的見單個(gè)巨大孤立性癌腫；鏡下癌細(xì)胞呈梁狀腺樣結(jié)構(gòu)，彌漫性分布。④EPCs中濃度6、8周組和EPCs高濃度4周組介于③和⑤之間。⑤EPCs高濃度6、8周組大鼠肝臟外觀呈黃褐色，表面見形狀不規(guī)則的結(jié)節(jié)，有的伴有多個(gè)巨大癌腫，邊緣清楚，可有纖維包膜包繞；鏡下癌細(xì)胞呈梁狀或腺樣或硬癌樣結(jié)構(gòu)。3.2免疫組化染色：3.2.1免疫組化染色

9、觀察：EPCs實(shí)驗(yàn)組中DAPI均呈陽性，且依注射EPCs懸液濃度高低和時(shí)間長(zhǎng)短呈上升趨勢(shì)，表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在視野中密集分布，染色漸深。3.2.2免疫組化染色圖像的半定量分析：①EPCs低、中、高濃度4周組，EPCs低、中、高濃度6周組和EPCs低、中、高濃度8周組PA值比較：差異具有顯著性（P<0.05）；②低濃度EPCs4、6、8周組，中濃度EPCs4、6、8周組和高濃度EPCs4、6、8周組PA值比較：差異具有顯著性（P<0.05）；

10、4.血清學(xué)指標(biāo)的變化：①DEN對(duì)肝功的影響：模型對(duì)照4周組、低濃度EPCs4周組與空白對(duì)照組比較，ALT，AST均顯著升高（P<0.05），ALB顯著降低（P<0.05）。②EPCs對(duì)肝功的影響：EPCs低、中、高濃度4周組，EPCs低、中、高濃度6周組和EPCs低、中、高濃度8周組比較，ALT，AST均顯著升高（P<0.05），ALB顯著降低（P<0.05）。低濃度EPCs4、6、8周組，中濃度EPCs4、6、8周組和高濃度EPCs4

11、、6、8周組比較，ALT，AST逐漸升高，差異具有顯著性（P<0.05），ALB逐漸降低，差異具有顯著性（P<0.05）。⑧AFP變化：模型對(duì)照4周組、低濃度EPCs4周組與空白對(duì)照組比較，明顯升高，有顯著差異（P<0.05），EPCs低、中、高濃度4周組，EPCs低、中、高濃度6周組和EPCs低、中、高濃度8周組比較，明顯升高，有顯著差異（P<0.05），低濃度EPCs4、6、8周組，中濃度EPCs4、6、8周組和高濃度EPCs4、6

12、、8周組比較，逐漸升高，差異具有顯著性（P<0.05）。 結(jié)論：①DEN制作大鼠肝癌模型，具有造模周期短、成功率高、所形成的肝癌模型類似于人類肝癌的發(fā)病、損傷機(jī)理和病理特點(diǎn)，是研究肝癌發(fā)病與防治較理想的模型之一。②EPCs體內(nèi)示蹤在肝組織的分布和表達(dá)水平表明其對(duì)肝癌有靶向作用。③EPCs對(duì)肝癌形成過程有促進(jìn)作用。④EPCs在肝癌形成過程中對(duì)肝功能有影響，且隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)及注射EPCs濃度的升高而加重。⑤EPCs靶向到達(dá)肝癌組