丹參酮ⅡA在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、丹參酮IIA(tanshinone IIA，TS IIA)是中藥丹參根中的脂溶性有效成分，大量藥效學(xué)研究及臨床觀察表明具有多種藥理作用，如心血管作用、抗腫瘤作用、抗肝纖維化作用、抗白血病作用、抗菌作用等。相對(duì)其大量豐富的藥效學(xué)研究數(shù)據(jù)，目前對(duì)TS ⅡA藥代動(dòng)力學(xué)的特征并不十分了解，因此深入研究TS IIA的藥代動(dòng)力學(xué)行為特征和相關(guān)機(jī)制，對(duì)全面了解其吸收特性、分布、代謝、排泄特點(diǎn)，指導(dǎo)TS ⅡA的新藥研究開發(fā)具有重要意義。 本研究

2、的主要目的是系統(tǒng)地研究TS ⅡA在大鼠體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄過程，同時(shí)利用各種整體、在體、體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ完U明TS ⅡA在小腸的吸收特性、肝/腸首過效應(yīng)對(duì)吸收過程的影響、TS ⅡA及其結(jié)合型是否存在肝腸循環(huán)，為TS ⅡA的新藥開發(fā)、為其它丹參酮類化合物的藥代動(dòng)力學(xué)研究提供理論依據(jù)。同時(shí)，通過研究參與TS ⅡA代謝所涉及的代謝酶以及TS ⅡA對(duì)細(xì)胞色素P450酶主要亞型的活性影響，為預(yù)測(cè)潛在的代謝性相互作用，為臨床合理用藥提供參考。

3、 一、大鼠生物樣品中TS ⅡA分析方法的建立 建立并驗(yàn)證生物樣品中TS ⅡA的靈敏、特異、可靠、線性范圍廣的檢測(cè)方法。采用乙醚液．液萃取提取生物樣品中的TS ⅡA和內(nèi)標(biāo)氯雷他定，采用液相色譜．串聯(lián)質(zhì)譜方法檢測(cè)。離子源為電噴霧離子化源(ESI)；檢測(cè)方式為正離子檢測(cè)；掃描方式采用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)，用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z 295→249(TS IIA)和m/z 383→266(氯雷他定)。色譜分析柱為Hyper

4、sil BDS C<,18>柱(2.1 mm×50 mm，5lμm)；流動(dòng)相為甲醇-水(90：10，v/v)(水中含1﹪甲酸)；流速為300 μL/min；每個(gè)樣品的分析時(shí)間為2 min。分析方法的定量下限為1.0ng/mL，各生物樣品中TS IIA的線性相關(guān)程度良好(r<'2>均大于0.99)。以質(zhì)控樣品計(jì)算該分析方法的批內(nèi)精密度RSD在1.3﹪～13.6﹪范圍內(nèi)，批間精密度RSD在1.0﹪～10.9﹪范圍內(nèi)；方法的準(zhǔn)確度在90.5﹪

5、～112.1﹪之間；方法的提取回收率在血漿中為60.2﹪～67.3﹪，在肝勻漿中為68.6﹪～71.4﹪，在尿、膽汁、糞勻漿中為50.7﹪～67.5﹪，在HBSS、腸灌流液、肝微粒體體系中為37.3﹪～49.6﹪。該分析方法經(jīng)驗(yàn)證結(jié)果滿意，樣品處理及檢測(cè)過程較已報(bào)道的方法簡(jiǎn)單、快速，可滿足TS ⅡA臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究的要求。 二、Ts ⅡA在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)及生物利用度研究 研究單次口服或靜脈注射給予6.7、 20

6、、60 mg/kg三個(gè)劑量的TS IIA后原型及結(jié)合型TS IIA在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)及生物利用度。采用高效液相色譜．串聯(lián)質(zhì)譜(LC/MS/MS)方法測(cè)定血漿中TS ⅡA的濃度，用非房室模型計(jì)算其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示，大鼠靜脈注射給予相當(dāng)于TS ⅡA 6.7、20、60 mg/kg三個(gè)劑量的TS ⅡA包合物后，低劑量大部分時(shí)間點(diǎn)、中劑點(diǎn)少部分時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)不到原型TS ⅡA；給藥約15～30 min后以結(jié)合型TS ⅡA占主導(dǎo)地位；靜脈

7、給藥后原型和結(jié)合型TS IIA在大鼠體內(nèi)基本符合非線性藥代動(dòng)力學(xué)。大鼠口服6.7、20、60 mg/kg三個(gè)劑量的TS ⅡA純品后，在體循環(huán)內(nèi)原型藥物僅以低水平存在，而以結(jié)合型TS ⅡA為主；TS ⅡA口服后的生物利用度非常低，以原型計(jì)只有(5.0±1.6)﹪；口服后原型和結(jié)合型TS ⅡA在大鼠體內(nèi)符合線性藥代動(dòng)力學(xué)；其血漿藥物濃度一時(shí)間曲線呈現(xiàn)多峰現(xiàn)象。胃腸吸收不齊性可能會(huì)造成出現(xiàn)多峰現(xiàn)象；而組織再分布或肝腸循環(huán)是否造成多峰現(xiàn)象的原因

8、，需要進(jìn)行組織分布實(shí)驗(yàn)和通過考察肝腸循環(huán)現(xiàn)象來確證。對(duì)口服后TS ⅡA低生物利用度的原因，有必要通過研究TS ⅡA的腸吸收機(jī)制及肝/腸首過效應(yīng)等現(xiàn)象來作進(jìn)一步分析。 三、Ts ⅡA吸收特性、首過效應(yīng)研究及影響生物利用度的因素分析 通過在體腸灌流模型、體外Caco-2細(xì)胞模型考察了TS ⅡA的吸收特性和代謝；通過體外肝微粒體轉(zhuǎn)化技術(shù)、離體肝臟灌流模型、腹腔注射給藥等方法考察了肝臟對(duì)TS ⅡA的首過效應(yīng)。從TS ⅡA的理化物

9、質(zhì)、劑型、胃腸道穩(wěn)定性分析了其它影響TS ⅡA口服生物利用度的因素。Caco-2細(xì)胞模型及腸灌流的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TS ⅡA的小腸膜通透性非常差，造成極低的小腸吸收；灌流小腸的血循環(huán)中只檢測(cè)到結(jié)合型TS ⅡA的存在，說明小腸是形成葡萄糖醛酸結(jié)合型TS ⅡA的另一個(gè)代謝場(chǎng)所。大鼠肝微粒體轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、離體肝灌流實(shí)驗(yàn)、腹腔注射給藥的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TS ⅡA在肝臟有顯著的首過效應(yīng)，能被肝臟迅速代謝、滯留、排泄，肝臟對(duì)TS ⅡA有較高提取率。綜合TS

10、 ⅡA的理化性質(zhì)、劑型、胃腸道穩(wěn)定性等分析，造成TS IIA口服生物利用度極低的原因主要有：(1)TS IIA的小腸膜通透性非常差，小腸吸收少，導(dǎo)致極低的生物利用度；(2)TS ⅡA在大鼠小腸有首過代謝，在肝臟也有明顯的首過效應(yīng)，這也導(dǎo)致生物利用度降低；(3)TS ⅡA本身的理化物質(zhì)，如水溶性低和強(qiáng)親脂性也對(duì)其低生物利用度造成影響；(4)TS ⅡA在胃腸道的穩(wěn)定性以及劑型差異對(duì)TS ⅡA的生物利用度影響不大。 四、Ts ⅡA在大

11、鼠體內(nèi)的分布研究 研究口服和靜脈注射給藥后原型TS ⅡA在大鼠各組織中的分布特點(diǎn)及組織中藥物濃度隨時(shí)間的變化規(guī)律。大鼠單次口服或靜脈注射給予TS ⅡA 60 mg/kg后于0．5、4、10、24、48、72、96、144 h(192、288 h)處死動(dòng)物，取各組織器官，制成0.5 g/mL勻漿，取勻漿處理，采用高效液相色譜．串聯(lián)質(zhì)譜(LC/MS/MS)方法測(cè)定各組織勻漿中TS ⅡA的濃度。結(jié)果顯示，TS ⅡA給藥后在體內(nèi)能迅速、

12、廣泛分布于各組織器官，并且絕大部分組織的藥物濃度遠(yuǎn)高于血漿藥物濃度。口服給藥時(shí)以胃腸道最高，其次是肺部和肝臟，靜注給藥時(shí)以肺部和肝臟最高；在腦組織以及睪丸中藥物濃度非常低，說明Ts ⅡA不易透過血一腦屏障和血一睪屏障進(jìn)入腦組織和睪丸。腎臟的藥物濃度不高，這與尿排泄結(jié)果吻合。給藥后第4天仍在較多的組織中檢測(cè)到TS ⅡA，在靜注給藥后第12天在肺部仍檢測(cè)到TSⅡA，說明藥物在組織消除較慢，而且在局部組織有較大量蓄積和較長(zhǎng)的滯留。TS ⅡA高

13、度脂溶性可能是造成TS ⅡA肺部蓄積以及廣泛高濃度組織分布的原因之一。TS ⅡA在組織的高濃度與血藥濃度的極低現(xiàn)象提示組織再動(dòng)員再分布的可能性，組織中高濃度的藥物很可能會(huì)重新釋放入血，形成藥物在體內(nèi)的再分布，從而造成TS ⅡA藥時(shí)曲線的多峰現(xiàn)象。 五、TS ⅡA在大鼠體內(nèi)的排泄及肝腸循環(huán)的研究 大鼠單次口服或靜脈注射給予TS ⅡA 60 mg/kg后收集尿液、膽汁和糞便樣品，采用高效液相色譜．串聯(lián)質(zhì)譜(LC/MS/MS)

14、方法測(cè)定樣品中原型和總TS ⅡA的濃度，計(jì)算藥物累積排泄量和累積排泄百分率。通過膽汁引流組與非膽汁引流組的數(shù)據(jù)比較、Linked-rat模型、十二指腸給予膽汁排泄物的重吸收實(shí)驗(yàn)來考察藥物的肝腸循環(huán)。結(jié)果顯示，TS ⅡA靜脈給藥后原型藥物和總TS ⅡA經(jīng)尿排泄累積百分率為0.01﹪、0.03﹪，經(jīng)膽汁排泄為3.5﹪、12.7﹪，經(jīng)糞排泄為15.25﹪、16.5﹪，經(jīng)尿、糞、膽汁排泄的累積百分率原型藥物為18.7﹪，總TS ⅡA為29.2﹪

15、，有限的原型藥物排泄提示大部分藥物在體內(nèi)可能廣泛代謝為其它產(chǎn)物。TS ⅡA口服給藥后原型藥物和總TS ⅡA經(jīng)尿排泄累積百分率為0.0026﹪、0.0031﹪，經(jīng)膽汁排泄為2.4﹪、4.6﹪，經(jīng)糞排泄為62.0﹪、72.6﹪，經(jīng)尿、糞、膽汁排泄的累積百分率原型藥物為64.4﹪，總TS ⅡA為77.2﹪?？梢?，藥物自尿的排泄非常有限，而糞和膽汁是TS ⅡA的主要排泄途徑。膽汁引流組與非膽汁引流組的比較、Linked-rat模型實(shí)驗(yàn)、十二指腸

16、給予膽汁的重吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，原型TS ⅡA和結(jié)合型TS ⅡA均可形成肝腸循環(huán)；結(jié)合型TS ⅡA的肝腸循環(huán)對(duì)其藥代動(dòng)力學(xué)行為有顯著影響，而原型TS ⅡA的肝腸循環(huán)未對(duì)其藥代動(dòng)力學(xué)造成影響。 六、Ts ⅡA在大鼠肝微粒體的代謝及對(duì)CYP酶亞型的體外抑制作用 研究TS IIA在大鼠肝微粒體酶中的代謝，選擇性細(xì)胞色素(CYP)酶抑制劑對(duì)TS ⅡA代謝的影響，以及TS ⅡA對(duì)大鼠6種主要CYP450酶亞型活性的影響。結(jié)果顯示，T

17、S ⅡA在大鼠肝微粒體酶中的最大反應(yīng)速率(V<,max>)為(1.20±0.18)nmol/min/mg protein；米氏常數(shù)(K<,m>)為(4.35±0.67)nmol/mL；對(duì)藥物的清除率CL<,int>為(0.28±0.06)mL/min/mg protein。噻氯匹啶和酮康唑能夠顯著抑制TS ⅡA的代謝，奎尼丁對(duì)TS ⅡA的代謝也有一定的抑制作用，而其他CYP酶抑制劑對(duì)TS ⅡA的代謝無明顯影響。由以上結(jié)果來看，C’YP2