鼠精子抗原Sp17與IL-5融合蛋白的克隆表達及其免疫性避孕效研究.pdf

1、隨著基因重組技術(shù)的發(fā)展和人們對生殖分子生物學(xué)的深入認識，免疫性避孕疫苗的研究是將來避孕節(jié)育研究的重要方向，免疫性避孕疫苗可能成為控制人口過度增長的理想措施。針對精子/睪丸抗原的免疫性避孕疫苗因可能適用于兩性，而一直受到研究者的青睞。 本研究的主要結(jié)果及結(jié)論如下： 1.采用RT-PCR方法，從小鼠睪丸中擴增了編碼精子蛋白Sp17的cDNA序列，通過定向克隆的方法將基因插入表達載體pET-28a(+)，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET/

2、Sp17。再以質(zhì)粒pGEM-1-IL-5為模板擴增小鼠IL-5基因片段，通過限制性內(nèi)切酶定向克隆到pET/Sp17中，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET/IL-5-Sp17。 2.將重組質(zhì)粒pET/Sp17和pET/IL-5-Sp17轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE分析顯示：Sp17和IL-5-Sp17均獲得表達，所獲重組蛋白分子量分別約25kD、39kD大小，與預(yù)期的Sp17、IL-5-Sp17重組蛋白

3、分子量理論值相近。用Ni2+-NTAAgarose親和層析柱純化后得到的重組蛋白Sp17和IL-5-Sp17的純度分別約為88.9％和91％。Westernblot進一步證實了Sp17和IL-5-Sp17蛋白的表達。 3.融合蛋白IL-5-Sp17鼻內(nèi)免疫小鼠后，檢測其血清和生殖道特異抗體IgG和IgA滴度。各實驗組小鼠于初次免疫后2周，血清及陰道沖洗液開始出現(xiàn)Sp17特異性抗體IgG及IgA反應(yīng)，隨后快速上升，多于初次免疫后6

4、～8周達到峰值，抗體最高水平分別可達1：128000和1：1280，持續(xù)3周后略有下降。在初次免疫后4周開始，IL-5-Sp17、Sp17+IL-5組的特異性IgG及IgA抗體滴度均顯著高于同期未使用佐劑的Sp17組(p＜0.01)。提示IL-5-Sp17蛋白疫苗鼻內(nèi)免疫時可明顯增強生殖道粘膜免疫反應(yīng)，同時還可誘導(dǎo)系統(tǒng)免疫應(yīng)答。 4.對免疫結(jié)束后10天之小鼠的脾臟淋巴細胞增殖率及淋巴細胞分泌的IL-4和INF-γ檢測顯示：IL-

5、5-Sp17免疫后的小鼠脾臟淋巴細胞增殖率升高，淋巴細胞培養(yǎng)上清液中分泌的IL-4和INF-γ也升高，且以IL-4更明顯。對IL-5-Sp17免疫后的小鼠血清亞型分析顯示：IgG1高于IgG2a水平。表明IL-5-Sp17鼻內(nèi)免疫誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的免疫反應(yīng)以Th2型為主，有利于機體的體液免疫應(yīng)答。 5.鼻內(nèi)免疫小鼠后，IL-5-Sp17、IL5+Sp17、Sp17組雌鼠的妊娠率分別降至15.4％、28.6％、57.1％，每胎產(chǎn)仔數(shù)分

6、別降至4.88，5.0和4.75只，與對照組相比，均有顯著下降。而且IL-5-Sp17組的妊娠率顯著低于未使用佐劑的Sp17組。提示精子抗原Sp17在應(yīng)用佐劑后均可產(chǎn)生不同程度的免疫性避孕效應(yīng)，但均未能完全阻斷所有雌鼠的生育力。 6.IL-5-Sp17免疫后小鼠的組織病理學(xué)觀察未發(fā)現(xiàn)肝臟、脾臟、腎臟、肺、腦、卵巢及睪丸的明顯結(jié)構(gòu)改變。免疫后小鼠及其分娩的子代鼠的PCE/NCE和微核率與正常小鼠相比無明顯差別。提示融合蛋白IL-5