山里紅葉化學成分及抗脂肪肝作用研究.pdf

1、山里紅葉是薔薇科植物山里紅(Crataegus pinnatifida Bge.var.majorN.E.Br.)的干燥葉,是《中華人民共和國藥典》2005版收載的山楂葉的一種。本文采用山里紅葉作為研究對象,采用現(xiàn)代藥理及分析方法,研究了山里紅葉提取物的抗脂肪肝作用及其活性成分。
　　 本研究首先采用復合方式建立高血脂造成大鼠脂肪肝模型對山里紅葉提取物預防脂肪肝的藥理作用進行研究。并對藥理實驗結(jié)果進行方差分析,結(jié)果表明:山里紅葉

2、的70％乙醇提取物對降脂藥理指標均有非常顯著的影響,與模型組相比血清總膽固醇(TC),血清甘油三脂(TG),血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST),高密度脂蛋白膽固醇(HDL)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL),肝體比及病理學檢查等指標有顯著變化(P<0.05),結(jié)果說明70％乙醇提取物有明顯預防脂肪肝的作用。提取物經(jīng)AB-8大孔樹脂處理后,再經(jīng)溶劑萃取,所得的氯仿、正丁醇及水三個部位提取物進行抗脂肪肝藥理作用研究,最后經(jīng)藥理實驗研

3、究證明山里紅葉70％乙醇提取物中的正丁醇萃取層為最佳活性部位。
　　 本研究首次對山里紅葉抗脂肪肝的最佳活性部位提取的工藝進行優(yōu)化,以70％乙醇為溶劑進行提取,并對70％乙醇用量、提取時間和提取次數(shù)三個因素進行了考察,篩選最佳提取工藝。目前中藥、天然藥物及活性成分的提取分離和純化常以大孔吸附樹脂作為處理手段。因此,本研究以總黃酮類成分及出膏率為指標,對AB-8、D-101、NKA-9三種型號大孔吸附樹脂進行了考察,確定以AB-8

4、對提取物進行純化,先用水除去雜質(zhì)后,再采用70％乙醇洗脫總黃酮,減壓回收乙醇,以氯仿、正丁醇分別萃取,確定最佳純化工藝。
　　 為明確山里紅葉提取物抗脂肪肝藥效成分,研究中對活性部位的化學成分進行分離。按山里紅葉活性部位最佳提取工藝,采用70％乙醇作為提取溶劑,經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂處理后,以氯仿、正丁醇分別萃取。正丁醇層提取物以硅膠柱色譜、聚酰胺柱色譜、薄層色譜等技術(shù)進行分離純化,運用ESI-Ms及NMR等技術(shù)進行了化學結(jié)構(gòu)鑒

5、定,并與相關(guān)文獻對照,由正丁醇層中分離純化得到了9種化合物,其中牡荊素-4'-O-葡萄糖苷,牡荊素-4'-鼠李糖苷為在該植物中首次發(fā)現(xiàn)。
　　 中藥的各種化學成分是防治疾病的物質(zhì)基礎,以一種指標性成分的含量測定作為質(zhì)量控制依據(jù),難以全面反映該藥品藥效。因此,本文首次建立了以HPLC色譜技術(shù),并采用內(nèi)標法對山里紅葉提取物中8種活性成分同時測定,方法先進、準確、可靠。另外標準提取物制定是要以確定藥材采收期作為前提的,故本文以山里葉8

6、種活性成分含量的動態(tài)變化為依據(jù),再結(jié)合山里紅葉產(chǎn)率,系統(tǒng)研究了山里紅葉的化學成分一采收時間之間相互關(guān)系的動態(tài)特征,進而確定山里紅葉最佳采收期,為山里紅葉標準提取物研制提供前提保證。
　　 抗氧化與脂肪肝有著密切關(guān)系,為了研究抗脂肪肝作用機制,本文首次采用細胞培養(yǎng)技術(shù)對山里紅葉提取物中活性部位主要黃酮類成分牡荊素-2"-O-鼠李糖苷進行抗氧化研究。首次采用高效液相色譜法,結(jié)合TBA衍生化技術(shù),定量測定ECV304細胞培養(yǎng)液中氧化產(chǎn)

7、物MDA,并根據(jù)氧化產(chǎn)物MDA含量,定量研究牡荊素-2"-O-鼠李糖苷活性成分抗氧化作用能力。研究結(jié)果證明牡荊素-2"-O-鼠李糖苷有較高的保護ECV304細胞損害作用,具有較強的抗氧化能力。對于0.5 mmol·L-1 TBHP誘導氧化細胞反應,牡荊素-2"-O-鼠李糖苷在15.6～125μmol·L-1劑量范圍內(nèi)作用24 h,顯著地抑制TBHP誘導ECV304細胞氧化,隨著劑量的增加,這種抑制顯著增強,結(jié)果證明牡荊素-2"-O-鼠李

8、糖苷最適當濃度為62.5μmol·L-1,這說明在此濃度內(nèi),該化合物顯示劑量依賴抗氧化效應,超過此濃度時,MDA濃度降低緩慢。
　　 本文首次建立了HPLC-UV法測定牡荊素-2"-O-鼠李糖苷四個劑量靜脈給藥的大鼠血漿濃度分析方法,以橙皮苷為內(nèi)標測定血漿中牡荊素-2"-O-鼠李糖苷。結(jié)果表明:大鼠靜脈給藥牡荊素-2"-O-鼠李糖苷的藥物動力學符合二室模型、具有線性動力學特征,這些結(jié)果為其開展臨床試驗提供了重要的理論依據(jù),有利于

9、臨床給藥方案的設計及闡明藥效、副反應等。由于黃酮苷類某些成分的特點,經(jīng)口服后,化學成分與腸道菌群發(fā)生相互作用而影響藥物吸收,再則由于分析儀器靈敏度的限制等因素,因此,文獻報道口服給藥山里紅葉活性成分體內(nèi)藥代動力學研究較少。本文首次建立了UPLC-MS/MS法測定口服給藥山里紅葉提取物及單體牡荊素-2"-O-鼠李糖苷大鼠血漿中牡荊素-2"-O-鼠李糖苷的分析方法,專屬性強,靈敏度高,分析速度快,有良好的精密度及準確度,非常適用于牡荊素-2

10、"-O-鼠李糖苷藥代動力學研究。樣品僅需一步萃取,操作簡單,定量下限為10 ng·mL-1,其檢測限可達2 ng·mL-1,每個樣品分析時間僅需3.0min,為研究山里紅葉提取物及活性成分在大鼠體內(nèi)藥物動力學研究提供了可靠的分析手段。實驗結(jié)果表明:牡荊素-2"-O-鼠李糖苷在大鼠體內(nèi)360min內(nèi)基本消除,灌胃給藥牡荊素-2"-O-鼠李糖苷與山里紅葉提取物相比,其吸收達峰時間基本一致,血漿中檢測到牡荊素-2"-O-鼠李糖苷濃度較低,Cm

11、ax和AUC較小,其他藥動參數(shù)與提取物給藥基本一致。牡荊素-2"-O-鼠李糖苷在大鼠血漿中藥-時曲線符合二室模型的一級吸收。
　　 總之,本研究是多學科技術(shù)相結(jié)合,研究了山里紅葉提取物抗脂肪肝作用及其活性成分,研究結(jié)果可為山里紅葉的應用開發(fā)提供實驗依據(jù),為中藥的現(xiàn)代化研究進行了有意義的探索。本實驗僅對牡荊素-2"-O-鼠李糖苷的抗氧化和體內(nèi)動力學進行了研究,其他成分尚需進一步研究,以全面闡明山里紅葉提取物中活性成分與藥理作用的密