銀杏葉提取物對(duì)白介素-1β?lián)p傷大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的根據(jù)銀杏葉提取物對(duì)其它組織和細(xì)胞具有清除氧自由基和一氧化氮(NO)，抑制炎癥細(xì)胞中核因子-κB(NF-κB)核移位的研究，結(jié)合骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中的NO和NF-κB的作用機(jī)制，本研究觀察銀杏葉提取物EGb對(duì)重組大鼠白介素-1β(rratIL-1β)損傷的大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的作用，并從自由基、一氧化氮、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)等環(huán)節(jié)了解銀杏葉提取物對(duì)受損傷軟骨細(xì)胞的作用機(jī)制，為OA的

2、預(yù)防和治療摸索新的治療藥物和治療途徑。 方法1軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定：半無菌環(huán)境下取1月齡清潔級(jí)wistar大鼠膝關(guān)節(jié)面軟骨層，在無菌環(huán)境下消化得到軟骨細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為第2代軟骨細(xì)胞。采用檢測培養(yǎng)物中的細(xì)胞外基質(zhì)成分來確定軟骨細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞并照相。 2軟骨細(xì)胞與rratIL-1β(5μg/L)、rratIL-1β(5μg/L)+不同濃度地塞米松(10-7、10-6、10-5mmol/L)、rratIL-1β(5

3、μg/L)+銀杏葉提取物EGb761(40mg、80mg、160mg/L)共同孵育，含正常細(xì)胞組共8組，72小時(shí)后，MTT法檢測軟骨細(xì)胞的增殖受到的影響；考馬斯亮藍(lán)G-250檢測細(xì)胞總蛋白。 3同如上分組，軟骨細(xì)胞在孵育24小時(shí)后取培養(yǎng)液上清，SOD、iNOS活性采用化學(xué)比色法測定，NO應(yīng)用硝酸還原酶法測定，RT-PCR檢測iNOSmRNA相對(duì)含量，觀察EGb761對(duì)rratIL-1β?lián)p傷后的軟骨細(xì)胞NO、iNOS活性、iNOS

4、mRNA表達(dá)、SOD的影響。 4軟骨細(xì)胞與rratIL-1β(5μg/L)、rratIL-1β(5μg/L)+地塞米松(10-6mmol/L)、rratIL-1β(5μg/L)+銀杏葉提取物EGb761(40mg、80mg、160mg/L)共同孵育，含正常細(xì)胞組共6組，ELISA法檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子NF-κBp65的活化情況及大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-13含量。結(jié)果：1.培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)部分存在酸性糖胺多糖呈異染性，呈淺藍(lán)色或紫紅色

5、，鑒定培養(yǎng)細(xì)胞為軟骨細(xì)胞的表型。細(xì)胞接種1周后在鏡下可以見到較多呈圓形或多角形，分泌少量細(xì)胞外基質(zhì)的軟骨細(xì)胞，20天左右達(dá)到傳代的標(biāo)準(zhǔn)。傳代后，細(xì)胞變?yōu)槎嘟切?，?xì)胞外基質(zhì)分泌增多。 2.MTT法顯示rratIL-1β對(duì)軟骨細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，考馬斯亮藍(lán)試驗(yàn)顯示細(xì)胞總蛋白分泌減少；地塞米松同EGb761均可對(duì)抗rratIL-1β的效應(yīng)。EGb761的這種效應(yīng)有劑量依賴性，而地塞米松沒有這種效應(yīng)。 3.rratIL-

6、1β?lián)p傷后的軟骨細(xì)胞NO、iNOSmRNA分泌增多、iNOS活性加強(qiáng)、SOD減少；地塞米松同EGb761均可對(duì)抗rratIL-1β增加NO、iNOSmRNA分泌、iNOS活性加強(qiáng)的效應(yīng)，EGb761的對(duì)抗效應(yīng)有劑量依賴性，而地塞米松沒有這種效應(yīng)；EGb761增加SOD作用強(qiáng)，并有明顯的劑量依賴性；地塞米松改善軟骨細(xì)胞分泌SOD的效應(yīng)不明顯。 4.rratIL-1β?lián)p傷后的軟骨細(xì)胞核內(nèi)NF-κBp65的活化顯著增強(qiáng)，EGb761劑

7、量依賴性的抑制這種效應(yīng)；rratIL-1β?lián)p傷后的軟骨細(xì)胞MMP-13分泌增多，EGb761劑量依賴性的抑制這種效應(yīng)。 結(jié)論銀杏葉提取物EGb761對(duì)rratIL-1β?lián)p傷的大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的具備很好的保護(hù)效應(yīng)，EGb761通過清除自由基和NO，減少iNOSmRNA表達(dá)并抑制iNOS活性，抑制NF-κBp65活化，減少M(fèi)MP-13生成等途徑對(duì)抗rratIL-1β對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的損傷作用，保護(hù)受損傷的軟骨細(xì)胞，EGb761