中藥丹皮酚防治腹膜粘連的研究.pdf

1、第一部分，丹皮酚對(duì)成纖維細(xì)胞和間皮細(xì)胞增殖率影響的研究。 目的:腹膜粘連是術(shù)后常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，其發(fā)生率可達(dá)90％以上，發(fā)生粘連的病例中，超過(guò)80％的患者在傷口與大網(wǎng)膜之間形成粘連，50％的病例涉及小腸。創(chuàng)傷尤其手術(shù)史是引起腸粘連最常見(jiàn)的原因。腸粘連可導(dǎo)致內(nèi)臟扭曲和換位并引起內(nèi)臟功能不全以及腹壁牽拉所致持續(xù)性疼痛。腹膜粘連還可引起慢性腹痛、女性不育等后果。我們既往研究發(fā)現(xiàn)，腹膜損傷是形成腹膜粘連的重要啟動(dòng)因素之一，而相鄰部位腹膜

2、的損傷是形成粘連的空間基礎(chǔ)；早期纖維的滲出為成纖維細(xì)胞的大量增殖并最終形成粘連機(jī)化提供了重要的“骨架”物質(zhì)；減少腹膜相鄰部位的損傷，早期促進(jìn)纖維蛋白溶解：促進(jìn)間皮細(xì)胞的腹膜修復(fù)，抑制成纖維細(xì)胞的增殖等。 方法：在預(yù)防腹膜粘連中可能均是不可或缺的手段。應(yīng)用口服中藥丹皮可修復(fù)間皮細(xì)胞、并且對(duì)成纖維細(xì)胞功能進(jìn)行有效的調(diào)控，從而減輕腹腔粘連的發(fā)生。臨床工作中遇到腹膜粘連的病人多數(shù)由于開(kāi)腹手術(shù)引起，術(shù)后需要一定時(shí)間的禁食，因此在胃腸功能

3、恢復(fù)以前，無(wú)法給予中藥口服治療，導(dǎo)致失去預(yù)防粘連發(fā)生的時(shí)間窗。如果找到一種非腸道給藥途徑的藥物，對(duì)于臨床應(yīng)用具有非常重要意義。丹皮酚是丹皮的主要有效成分，是否能起到與丹皮相同的作用，我們?cè)O(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)的目的在于進(jìn)一步研究丹皮的有效成分丹皮酚對(duì)間皮細(xì)胞、對(duì)成纖維細(xì)胞增殖率的影響。方法取健康Wistar大鼠20只，用于培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，間皮細(xì)胞，所培養(yǎng)細(xì)胞分組，成纖維細(xì)胞組為A組，間皮細(xì)胞為B組。成纖維細(xì)胞+1640組為A1組，成纖維

4、細(xì)胞+LPS組為A2組，成纖維細(xì)胞+TNF組為A3組，成纖維細(xì)胞+LPS+丹皮酚組為A4組，成纖維細(xì)胞+TNF+丹皮酚組為A5組，成纖維細(xì)胞+丹皮酚組為A6組；間皮細(xì)胞+1640組為B1組，間皮細(xì)胞+LPS組為B2組，間皮細(xì)胞+TNF組為B3組，間皮細(xì)胞+LPS+丹皮酚組為B4組，間皮細(xì)胞+TNF+_丹皮酚組為B5組，間皮細(xì)胞+丹皮酚組為B6組。培養(yǎng)1天后，采用MTT法計(jì)數(shù)，并進(jìn)行HE染色做細(xì)胞鑒定。 結(jié)果：?jiǎn)为?dú)使用LPS和T

5、NF均可以刺激成纖維細(xì)胞增殖，加入丹皮酚后能明顯降低LPS和TNF作用下的成纖維細(xì)胞增殖；單獨(dú)使用LPS可以刺激間皮細(xì)胞增殖，加入丹皮酚的干預(yù)作用后，可以降低LPS作用下間皮細(xì)胞的增殖率，單獨(dú)使用TNF抑制間皮細(xì)胞增殖，而加入丹皮酚后能部分抵制TNF抑制作用，促進(jìn)間皮細(xì)胞增殖和修復(fù)。 結(jié)論：間皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞是腹膜粘連過(guò)程中起主要作用的細(xì)胞，一般認(rèn)為腹膜受到刺激時(shí)，間皮細(xì)胞功能降低、數(shù)量下降，成纖維細(xì)胞進(jìn)入活化狀態(tài)、過(guò)度增殖

6、。細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)變化后，在機(jī)體復(fù)雜生理機(jī)能作用下，起動(dòng)腹膜粘連過(guò)程。中藥丹皮酚有直接抑制成纖維細(xì)胞活化增殖的作用，對(duì)間皮細(xì)胞的增殖具有上調(diào)作用，從而促進(jìn)腹膜的早期修復(fù)。 目的：Menzies提出，機(jī)械性損傷、組織缺血、異物刺激及腹膜炎等導(dǎo)致的漿膜損傷是腹膜粘連的主要誘因，既往研究表明，在腹膜粘連的過(guò)程中，纖維蛋白的滲出和凝固是形成是腹膜粘連重要環(huán)節(jié)。凝固的纖維蛋白溶解過(guò)程受到t-PA/PAI的有效調(diào)控。前期研究發(fā)現(xiàn)，t-PA、PA

7、I主要由腹膜間皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞分泌，本實(shí)驗(yàn)的目的在于為進(jìn)一步探討丹皮酚對(duì)間皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的粘連因子的影響作用。 方法：取健康Wistar大鼠20只，用于培養(yǎng)巨噬細(xì)胞及間皮細(xì)胞，所培養(yǎng)細(xì)胞分組，巨噬細(xì)胞組為A組，間皮細(xì)胞為B組。巨噬細(xì)胞+1640組為A1組，巨噬細(xì)胞+丹皮酚組為A2組，巨噬細(xì)胞+LPS組為A3組，巨噬細(xì)胞+LPS+丹皮酚組為A4組；間皮細(xì)胞+1640組為B1組，間皮細(xì)胞+LPS組為B2組，間皮細(xì)胞+TNF組為

8、B3組，間皮細(xì)胞+LPS+丹皮酚組為B4組，間皮細(xì)胞+巨噬細(xì)胞+丹皮酚組為B5組，間皮細(xì)胞+丹皮酚組為B6組。培養(yǎng)1天后收取上清液巨噬細(xì)胞測(cè)TNF、t-PA、PAI含量，間皮細(xì)胞測(cè)t-PA、PAI含量。 結(jié)果：丹皮酚可以明確下調(diào)受LPS激活的巨噬細(xì)胞分泌TNF及PAI水平；增加正常培養(yǎng)組及LPS組活化的巨噬細(xì)胞分泌t-PA的水平，炎癥細(xì)胞因子TNF及LPS可以上調(diào)間皮細(xì)胞分泌t-PA的水平，聯(lián)合使用丹皮酚后可以進(jìn)一步上調(diào)TNF活

9、化的間皮細(xì)胞分泌t-PA的水平，下調(diào)TNF活化的間皮細(xì)胞分泌PAI的水平，而對(duì)LPS活化的間皮細(xì)胞無(wú)作用；單獨(dú)使用丹皮酚對(duì)間皮細(xì)胞分泌t-PA及PAI均無(wú)顯著作用。 結(jié)論：炎癥因子釋放是腹膜粘連的病生理基礎(chǔ)之一，間皮細(xì)胞功能異常，引起t-PA/PAI值下降，纖溶酶活性下降，同時(shí)纖維蛋白滲出增多，造成纖維粘連。中藥丹皮酚可以通過(guò)改變巨噬細(xì)胞和間皮細(xì)胞及其它們分泌細(xì)胞因子之間相互作用，有效調(diào)控t-PA/PAI的分泌，促進(jìn)纖維蛋白溶解

10、，起到預(yù)防腹膜粘連的作用。 第二部分，丹皮酚對(duì)巨噬細(xì)胞、間皮細(xì)胞分泌t-PA . PAI調(diào)控作用的研究。 目的：腹膜粘連一般與創(chuàng)傷、炎癥、異物殘留等因素有關(guān)，是術(shù)后常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，其發(fā)生率可達(dá)90％以上，腸粘連可導(dǎo)致內(nèi)臟扭曲和換位并引起內(nèi)臟功能不全以及腹壁牽拉所致持續(xù)性疼痛。我們既往研究發(fā)現(xiàn)，中藥丹皮有活血化淤、減輕炎癥反應(yīng)等作用，可以進(jìn)一步減輕腹膜粘連。同時(shí)丹皮的有效成分丹皮酚可抑制成纖維細(xì)胞活化增殖，促進(jìn)間皮細(xì)胞增

11、殖和修復(fù)，調(diào)控間皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的粘連因子，為找到一種非腸道給藥途徑的藥物提供可能性。因此本實(shí)驗(yàn)的目的在于制作損傷性腹膜粘連的大鼠模型以了解丹皮酚對(duì)防治腹膜粘連的療效和病理形態(tài)學(xué)改變。 方法：取健康Wistar大鼠400只，隨機(jī)分為5組，每組80只，雌雄各半。進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)A組：創(chuàng)傷組，單純鉗夾腸壁，制造無(wú)菌性損傷模型；B組：創(chuàng)傷+中藥丹皮酚組，鉗夾腸壁，并于術(shù)后每天肌肉注射丹皮酚，注射量為8mg/kg；C組：創(chuàng)傷+透明質(zhì)酸鈉

12、組，利用A組的方法制作創(chuàng)傷粘連模型，于損傷大鼠小腸漿膜面處涂抹透明質(zhì)酸鈉0.2ml；D組：創(chuàng)傷+透明質(zhì)酸鈉+中藥丹皮酚粘連組在C組的基礎(chǔ)上，于術(shù)后每天肌肉注射丹皮酚，注射量為8mg/kg；E組：正常組，與前四組同時(shí)分時(shí)間段取材，做空白對(duì)照。以上各組大鼠在隨機(jī)分為4組，分別于術(shù)后3天、7天、14天、21天處死，觀察腹膜粘連情況，取粘連組織行HE染色，粘連分級(jí)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行Ridit分析。 結(jié)果：A組粘連最重，大體粘連程度比較A組>C