中藥丹皮酚防治腹膜粘連的研究.pdf

1、第一部分，丹皮酚對成纖維細胞和間皮細胞增殖率影響的研究。 目的:腹膜粘連是術(shù)后常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)生率可達90％以上，發(fā)生粘連的病例中，超過80％的患者在傷口與大網(wǎng)膜之間形成粘連，50％的病例涉及小腸。創(chuàng)傷尤其手術(shù)史是引起腸粘連最常見的原因。腸粘連可導(dǎo)致內(nèi)臟扭曲和換位并引起內(nèi)臟功能不全以及腹壁牽拉所致持續(xù)性疼痛。腹膜粘連還可引起慢性腹痛、女性不育等后果。我們既往研究發(fā)現(xiàn)，腹膜損傷是形成腹膜粘連的重要啟動因素之一，而相鄰部位腹膜

2、的損傷是形成粘連的空間基礎(chǔ)；早期纖維的滲出為成纖維細胞的大量增殖并最終形成粘連機化提供了重要的“骨架”物質(zhì)；減少腹膜相鄰部位的損傷，早期促進纖維蛋白溶解：促進間皮細胞的腹膜修復(fù)，抑制成纖維細胞的增殖等。 方法：在預(yù)防腹膜粘連中可能均是不可或缺的手段。應(yīng)用口服中藥丹皮可修復(fù)間皮細胞、并且對成纖維細胞功能進行有效的調(diào)控，從而減輕腹腔粘連的發(fā)生。臨床工作中遇到腹膜粘連的病人多數(shù)由于開腹手術(shù)引起，術(shù)后需要一定時間的禁食，因此在胃腸功能

3、恢復(fù)以前，無法給予中藥口服治療，導(dǎo)致失去預(yù)防粘連發(fā)生的時間窗。如果找到一種非腸道給藥途徑的藥物，對于臨床應(yīng)用具有非常重要意義。丹皮酚是丹皮的主要有效成分，是否能起到與丹皮相同的作用，我們設(shè)計了以下實驗。本實驗的目的在于進一步研究丹皮的有效成分丹皮酚對間皮細胞、對成纖維細胞增殖率的影響。方法取健康Wistar大鼠20只，用于培養(yǎng)成纖維細胞，間皮細胞，所培養(yǎng)細胞分組，成纖維細胞組為A組，間皮細胞為B組。成纖維細胞+1640組為A1組，成纖維

4、細胞+LPS組為A2組，成纖維細胞+TNF組為A3組，成纖維細胞+LPS+丹皮酚組為A4組，成纖維細胞+TNF+丹皮酚組為A5組，成纖維細胞+丹皮酚組為A6組；間皮細胞+1640組為B1組，間皮細胞+LPS組為B2組，間皮細胞+TNF組為B3組，間皮細胞+LPS+丹皮酚組為B4組，間皮細胞+TNF+_丹皮酚組為B5組，間皮細胞+丹皮酚組為B6組。培養(yǎng)1天后，采用MTT法計數(shù)，并進行HE染色做細胞鑒定。 結(jié)果：單獨使用LPS和T

5、NF均可以刺激成纖維細胞增殖，加入丹皮酚后能明顯降低LPS和TNF作用下的成纖維細胞增殖；單獨使用LPS可以刺激間皮細胞增殖，加入丹皮酚的干預(yù)作用后，可以降低LPS作用下間皮細胞的增殖率，單獨使用TNF抑制間皮細胞增殖，而加入丹皮酚后能部分抵制TNF抑制作用，促進間皮細胞增殖和修復(fù)。 結(jié)論：間皮細胞、成纖維細胞是腹膜粘連過程中起主要作用的細胞，一般認(rèn)為腹膜受到刺激時，間皮細胞功能降低、數(shù)量下降，成纖維細胞進入活化狀態(tài)、過度增殖

6、。細胞數(shù)量出現(xiàn)變化后，在機體復(fù)雜生理機能作用下，起動腹膜粘連過程。中藥丹皮酚有直接抑制成纖維細胞活化增殖的作用，對間皮細胞的增殖具有上調(diào)作用，從而促進腹膜的早期修復(fù)。 目的：Menzies提出，機械性損傷、組織缺血、異物刺激及腹膜炎等導(dǎo)致的漿膜損傷是腹膜粘連的主要誘因，既往研究表明，在腹膜粘連的過程中，纖維蛋白的滲出和凝固是形成是腹膜粘連重要環(huán)節(jié)。凝固的纖維蛋白溶解過程受到t-PA/PAI的有效調(diào)控。前期研究發(fā)現(xiàn)，t-PA、PA

7、I主要由腹膜間皮細胞及巨噬細胞分泌，本實驗的目的在于為進一步探討丹皮酚對間皮細胞和巨噬細胞分泌的粘連因子的影響作用。 方法：取健康Wistar大鼠20只，用于培養(yǎng)巨噬細胞及間皮細胞，所培養(yǎng)細胞分組，巨噬細胞組為A組，間皮細胞為B組。巨噬細胞+1640組為A1組，巨噬細胞+丹皮酚組為A2組，巨噬細胞+LPS組為A3組，巨噬細胞+LPS+丹皮酚組為A4組；間皮細胞+1640組為B1組，間皮細胞+LPS組為B2組，間皮細胞+TNF組為

8、B3組，間皮細胞+LPS+丹皮酚組為B4組，間皮細胞+巨噬細胞+丹皮酚組為B5組，間皮細胞+丹皮酚組為B6組。培養(yǎng)1天后收取上清液巨噬細胞測TNF、t-PA、PAI含量，間皮細胞測t-PA、PAI含量。 結(jié)果：丹皮酚可以明確下調(diào)受LPS激活的巨噬細胞分泌TNF及PAI水平；增加正常培養(yǎng)組及LPS組活化的巨噬細胞分泌t-PA的水平，炎癥細胞因子TNF及LPS可以上調(diào)間皮細胞分泌t-PA的水平，聯(lián)合使用丹皮酚后可以進一步上調(diào)TNF活

9、化的間皮細胞分泌t-PA的水平，下調(diào)TNF活化的間皮細胞分泌PAI的水平，而對LPS活化的間皮細胞無作用；單獨使用丹皮酚對間皮細胞分泌t-PA及PAI均無顯著作用。 結(jié)論：炎癥因子釋放是腹膜粘連的病生理基礎(chǔ)之一，間皮細胞功能異常，引起t-PA/PAI值下降，纖溶酶活性下降，同時纖維蛋白滲出增多，造成纖維粘連。中藥丹皮酚可以通過改變巨噬細胞和間皮細胞及其它們分泌細胞因子之間相互作用，有效調(diào)控t-PA/PAI的分泌，促進纖維蛋白溶解

10、，起到預(yù)防腹膜粘連的作用。 第二部分，丹皮酚對巨噬細胞、間皮細胞分泌t-PA . PAI調(diào)控作用的研究。 目的：腹膜粘連一般與創(chuàng)傷、炎癥、異物殘留等因素有關(guān)，是術(shù)后常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)生率可達90％以上，腸粘連可導(dǎo)致內(nèi)臟扭曲和換位并引起內(nèi)臟功能不全以及腹壁牽拉所致持續(xù)性疼痛。我們既往研究發(fā)現(xiàn)，中藥丹皮有活血化淤、減輕炎癥反應(yīng)等作用，可以進一步減輕腹膜粘連。同時丹皮的有效成分丹皮酚可抑制成纖維細胞活化增殖，促進間皮細胞增

11、殖和修復(fù)，調(diào)控間皮細胞和巨噬細胞分泌的粘連因子，為找到一種非腸道給藥途徑的藥物提供可能性。因此本實驗的目的在于制作損傷性腹膜粘連的大鼠模型以了解丹皮酚對防治腹膜粘連的療效和病理形態(tài)學(xué)改變。 方法：取健康Wistar大鼠400只，隨機分為5組，每組80只，雌雄各半。進行以下實驗A組：創(chuàng)傷組，單純鉗夾腸壁，制造無菌性損傷模型；B組：創(chuàng)傷+中藥丹皮酚組，鉗夾腸壁，并于術(shù)后每天肌肉注射丹皮酚，注射量為8mg/kg；C組：創(chuàng)傷+透明質(zhì)酸鈉

12、組，利用A組的方法制作創(chuàng)傷粘連模型，于損傷大鼠小腸漿膜面處涂抹透明質(zhì)酸鈉0.2ml；D組：創(chuàng)傷+透明質(zhì)酸鈉+中藥丹皮酚粘連組在C組的基礎(chǔ)上，于術(shù)后每天肌肉注射丹皮酚，注射量為8mg/kg；E組：正常組，與前四組同時分時間段取材，做空白對照。以上各組大鼠在隨機分為4組，分別于術(shù)后3天、7天、14天、21天處死，觀察腹膜粘連情況，取粘連組織行HE染色，粘連分級所得數(shù)據(jù)進行Ridit分析。 結(jié)果：A組粘連最重，大體粘連程度比較A組>C