電針任督脈和人臍血MSCs移植對(duì)腦缺血大鼠保護(hù)研究.pdf

1、廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是個(gè)人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工r’作所取得的成果。除文中已經(jīng)特別加以注明引用的內(nèi)容外，本論文不含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明并致謝。本人完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名遂!塑望日期：如H年j，月：；3日關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明本人完全了解廣州中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)保留使用學(xué)

2、位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留或向國家有關(guān)部門機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許被查閱和借閱。本人授權(quán)廣州中醫(yī)藥大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或其他復(fù)印手段保存和匯編本學(xué)位論文。(保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定)論文作者簽名拯鵝窆論文導(dǎo)師簽名日期：如《￥年r月；J只CD73、CDl05、CD44、CD29、CD45、CD34、CDl9、CDl4和HLA—DR的表達(dá)。取部分P3代的人臍血MSCs，

3、連續(xù)12天進(jìn)行細(xì)胞生長曲線測定。22電針任督脈經(jīng)穴聯(lián)合人臍血MSCs移植對(duì)腦缺血大鼠的干預(yù)機(jī)制研究SPF級(jí)成年健康雄性SD大鼠120只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、PBS移植組、人臍血MSCs移植組、電針督脈人臍血MSCs移植組和電針任督脈人臍血MSCs移植組。每組再分別隨機(jī)分成7天組、14天組和28天組，每亞組各8只。運(yùn)用線栓法造成動(dòng)物右側(cè)局灶性腦缺血再灌注模型。造模24小時(shí)后，人臍血MSCs移植組和聯(lián)合電針組都予以大鼠右側(cè)紋狀體和皮層下人臍血

4、MSCs移植，PBS移植組于相同部位以等量的PBS注射。聯(lián)合電針組在人臍血MSCs移植手術(shù)24小時(shí)后于任脈(承漿、氣海、關(guān)元)和督脈(大椎、百會(huì)、水溝)行電針治療，采用疏密波刺激(疏波30Hz，密波lOOHz)，強(qiáng)度6—15V，作用20min，每天1次直到老鼠處死為止。假手術(shù)組和PBS移植組在手術(shù)24小時(shí)后固定在動(dòng)物固定臺(tái)上20min，不進(jìn)行任何治療。各組大鼠按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間處死、取腦。運(yùn)用改良的神經(jīng)功能缺損評(píng)分(mNSS)評(píng)估每組大鼠神

5、經(jīng)功能缺損情況；運(yùn)用HE染色觀察各組動(dòng)物移植部位附近的病理形態(tài)學(xué)改變；運(yùn)用免疫組化方法對(duì)移植區(qū)域附近VEGF陽性細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記；運(yùn)用TUNEL法觀察移植區(qū)域附近腦組織細(xì)胞凋亡情況。利用德國LeiCaDCSoftware數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)軟件包行圖像分析。200倍光鏡下行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，利用SPSS150軟件行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)比各組間差異。3、結(jié)果：31本實(shí)驗(yàn)共分離培養(yǎng)17份臍血，成功培養(yǎng)出人臍血MSCs4份，成功率高達(dá)到235％。當(dāng)MNCs加入培

6、養(yǎng)基及生長因子進(jìn)行培養(yǎng)后，顯微鏡下觀察約3—7天即可見少量形態(tài)各異的貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)瓶內(nèi)含有大量懸浮的粒細(xì)胞。當(dāng)貼壁細(xì)胞增殖到一定量時(shí)進(jìn)行全量換液，此后約換液25次細(xì)胞融合度可達(dá)到80％以上，可見成纖維細(xì)胞樣克隆形成和形態(tài)相對(duì)均一的梭形細(xì)胞，呈漩渦狀生長或放射狀生長。傳代后細(xì)胞顯著加快其生長速度，于接種后第45天其生長趨勢(shì)最為明顯，數(shù)目顯著增加。第5、6天，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底，連接成片狀。整個(gè)原代培養(yǎng)需時(shí)約為15—30天，此后每傳1代約需4

7、5天。流式鑒定結(jié)果顯示，PO和P3代細(xì)胞均表達(dá)CD90、CD73、CDl05、CD44和CD29，不表達(dá)造血系細(xì)胞表面標(biāo)記CD45、CD34、CDl9或CDl4，對(duì)組織相容性免疫表型的分析顯示人臍血MSCs不表達(dá)HLA—DR抗原。32與假手術(shù)組大鼠對(duì)比，其余組動(dòng)物經(jīng)成功造模后，都表現(xiàn)出一定程度神經(jīng)功能缺損癥狀，如不能徹底伸展左前肢、向左側(cè)轉(zhuǎn)圈、向左側(cè)傾倒、不能自行行走且意識(shí)程度降低等。PBS移植組、人臍血MSCs移植組、督脈聯(lián)合人臍血M