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文檔簡介
1、目的:了解本地區(qū)耐多藥大腸埃希菌攜帶質(zhì)粒介導(dǎo)的CTX-M-14和CTX-M-15酶基因分布情況及對常見抗菌藥物的耐藥情況,并對溴化乙啶(EB)消除耐藥質(zhì)粒的影響進(jìn)行探討。
方法:1.CTX-M-14和CTX-M-15酶基因的檢測:1.1藥物敏感試驗紙片擴(kuò)散法(K-B法):對來自本地區(qū)2007年7月-2008年7月期間細(xì)菌感染患者的大腸埃希菌71株,從中選出多耐25株、雙耐15株及單耐16株等共56株大腸埃希菌藥物敏感試驗。1.
2、2 PCR技術(shù):提取質(zhì)粒DNA,以此為模板對CTX-M-14和CTX-M-15酶基因進(jìn)行擴(kuò)增。CTX-M-14引物序列為P1:5'-GAAAGAGAGTGCAACGGATG-3', P2:5'-ATTGGAAAGGGTTCATCACC-3';CTX-M-15引物序列為P1:5'-AAAAATCACTGCGCCAGTTC-3',P2:5'-AGCTTATTCATCGCCACGTT-3'。PCR反應(yīng)體系:共26μl,其中摸板6μl,引物每對
3、各1μl,2×TaqPCR MasterMix12.5μl,ddH2O5.5μl。在混勻后,加入PCR反應(yīng)管,然后再放入PCR擴(kuò)增儀。PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為:94℃預(yù)變性3分鐘,94℃變性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸60秒,共30個循環(huán),循環(huán)完成后72℃延伸5分鐘。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖電泳,標(biāo)準(zhǔn)菌株25922進(jìn)行陰性對照,在紫外線檢測儀下看結(jié)果,并用凝膠成像儀攝像,最后送上海生工進(jìn)行基因測序。1.3 CTX-M-4和CTX-M
4、-15酶基因陽性菌和陰性菌耐藥分析:即進(jìn)行藥物敏感試驗,對7種抗菌藥物對耐藥大腸埃希菌的CTX-M-14及CTX-M-15陽性和陰性菌株耐藥情況比較。2.質(zhì)粒消除試驗:選取多耐組大腸埃希菌中取攜帶CTX-M-14陽性大腸埃希菌21株,在含30μg/mlEB的培養(yǎng)液中粉餅振蕩培養(yǎng)64小時和120小時,分別進(jìn)行細(xì)菌質(zhì)粒DNA的提取,并使用PCR技術(shù)對目的基因CTX-M-14的檢測。對細(xì)菌質(zhì)粒消除前后作藥物敏感試驗。
結(jié)果:1 CT
5、X-M-14和CTX-M-15酶基因的檢測1.1藥物敏感試驗:56株大腸埃希菌耐藥率分別為亞胺培南(IMP)0,阿米卡星(AMK)12.5%,頭孢他啶(CAZ)55.4%,左氧氟沙星(LEV)60.7%,慶大霉素(GEN)62.5%,氨曲南(AZT)71.4%,頭孢噻肟(CTX)83.9%。1.2 CTX-M-14和CTX-M-15酶基因檢測結(jié)果:兩者的檢出率分別78.6%,50.0%。其中在多耐藥大腸埃希菌中,檢出率分別為96.0%,
6、48.0%;在雙耐藥大腸埃希菌中,檢出率分別為53.3%,60.0%;在單耐藥大腸埃希菌中,檢出率分別為75.0%,43.8%。大腸埃希菌質(zhì)粒攜帶CTX-M-14菌株檢出率,多耐組(96.0%)和雙耐組(53.3%)比較,經(jīng)X2檢驗,P<0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;多耐組(96.0%)和單耐組+雙耐組(64.5%)檢出率的比較,經(jīng)X2檢驗,P<0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。1.3按細(xì)菌攜帶CTX-M-14,CTX-M-15型別分組后藥
7、物敏感實驗結(jié)果:耐藥大腸埃希菌的CTX-M-14陽性和陰性菌株,對7種抗菌藥物耐藥情況比較,均為P>0.05;耐藥大腸埃希菌的CTX-M-15陽性和陰性菌株對氨曲南,頭孢噻肟耐藥率相比較,經(jīng)X2檢驗,P值分別為0.018,0.029,P<0.05,而對慶大霉素,阿米卡星,左氧氟沙星,頭孢他啶耐藥率相比較,經(jīng)X2檢驗,均為P>0.05;攜帶CTX-M-14,CTX-M-15酶基因的大腸埃希菌對頭孢噻肟與頭孢他啶的耐藥率比較,經(jīng)X2檢驗,均
8、為P<0.05,提示攜帶CTX-M-14,CTX-M-15酶基因的大腸埃希菌對頭孢噻肟耐藥率均高于頭孢他啶。2質(zhì)粒消除試驗結(jié)果2.1質(zhì)粒消除試驗后細(xì)菌質(zhì)粒CTX-M-14檢測:21株多耐藥大腸埃希菌對含30μg/mlEB的培養(yǎng)液,振蕩培養(yǎng)64小時,提取細(xì)菌質(zhì)粒DNA,PCR技術(shù)目的基因CTX-M-14的檢測,結(jié)果顯示:細(xì)菌的質(zhì)粒中CTX-M-14酶基因沒消除;大腸埃希菌對含30μg/mlEB的培養(yǎng)液,振蕩培養(yǎng)120小時,提取細(xì)菌質(zhì)粒DN
9、A,PCR技術(shù)目的基因CTX-M-14的檢測,結(jié)果顯示:21株細(xì)菌中,CTX-M-14酶基因只有1株轉(zhuǎn)為陰性。2.2質(zhì)粒消除試驗前后藥物敏感情況比較:經(jīng)質(zhì)粒消除試驗前后細(xì)菌耐藥率比較,經(jīng)X2檢驗,對頭孢西丁,環(huán)丙沙星,哌拉西林,頭孢曲松,頭孢噻肟,頭孢他啶,P>0.05,不具統(tǒng)計學(xué)意義;質(zhì)粒消除試驗前后細(xì)菌,對鏈霉素耐藥率比較,經(jīng)X2檢驗,X2=11.958,P=0.001,P<0.05,具統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)論:1.在耐藥大腸埃
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