腺病毒介導(dǎo)D2S基因聯(lián)合溴隱亭治療對(duì)人NFPA細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用.pdf

1、目的:探討通過腺病毒介導(dǎo)多巴胺2型受體短鏈亞型基因(D2S)感染原代培養(yǎng)的人垂體無功能腺瘤(NFPA)細(xì)胞，并聯(lián)合溴隱亭藥物干預(yù)對(duì)體外培養(yǎng)的NFPA細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響。
　　 方法:
　　 1、取細(xì)胞狀態(tài)良好且處于對(duì)于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NFPA細(xì)胞，在無血清的培養(yǎng)條件下，應(yīng)用重組腺病毒載體pAd-D2S-EGFP及pAd-EGFP空載體進(jìn)行感染，設(shè)置未轉(zhuǎn)染組做正常對(duì)照，在轉(zhuǎn)染后第12h、24 h、48 h時(shí)于激光共聚焦顯微鏡下

2、觀察綠色熒光蛋白表達(dá)。
　　 2、將NFPA細(xì)胞分為pAd-D2S-EGFP感染組、pAd-EGFP空載體組及正常對(duì)照組，分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染及換液處理后，Trizol法提取各組細(xì)胞的總RNA，采用RT-PCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)D2S基因的表達(dá)變化。
　　 3、取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的NFPA細(xì)胞，并制作爬片，在無血清的培養(yǎng)條件下，應(yīng)用重組腺病毒載體pAd-D2S-EGFP及pAd-EGFP空載體進(jìn)行感染，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組，孵育48h

3、后，用甲醛固定各組細(xì)胞并封片，采用免疫熒光染色法，檢測(cè)三組細(xì)胞D2S蛋白表達(dá)情況。
　　 4、應(yīng)用pAd-D2S-EGFP感染人NFPA細(xì)胞，并同步設(shè)立pAd-EGFP空載體組及未轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染48h后對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行溴隱亭體外藥物干預(yù)，相差顯微鏡下觀察并記錄轉(zhuǎn)染前后各組細(xì)胞形態(tài)變化。
　　 5、取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人NFPA細(xì)胞，按上述方法分組，轉(zhuǎn)染48 h后，用溴隱亭藥物干預(yù)，CCK-8法檢測(cè)干預(yù)后12h、24 h、36h、

4、48 h各組細(xì)胞活性。
　　 6、應(yīng)用Hoechst核染色法對(duì)藥物干預(yù)后的pAd-D2S-EGFP感染組、pAd-EGFP空載體組，及正常對(duì)照進(jìn)行細(xì)胞核凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)，激光共聚焦顯微鏡下觀察各組細(xì)胞核形態(tài)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1、腺病毒對(duì)原代培養(yǎng)的人NFPA細(xì)胞具有較高的感染效率，重組腺病毒pAd-D2S-EGFP和pAd-EGFP空載體分別轉(zhuǎn)染NFPA細(xì)胞24 h后，激光共聚焦顯微鏡下可觀察到較強(qiáng)的綠

5、色熒光表達(dá)。
　　 2、人NFPA細(xì)胞轉(zhuǎn)染D2S基因后，檢測(cè)到D2S基因的轉(zhuǎn)錄較對(duì)照組增高，D2S-EGFP轉(zhuǎn)染組、EGFP-空載體組、正常對(duì)照組的2-△△CT值分別為2.14±0.10、1.04±0.07和1.01±0.10，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3、經(jīng)過比較，人NFPA細(xì)胞轉(zhuǎn)染D2S基因后，D2S的蛋白表達(dá)較其他實(shí)驗(yàn)各組增加，表現(xiàn)為空白對(duì)照組無熒光表達(dá)，空載體組僅表達(dá)綠色熒光蛋白，實(shí)驗(yàn)組同時(shí)表達(dá)綠色熒光蛋白及紅色

6、熒光蛋白（紅色標(biāo)記D2S蛋白）。
　　 4、腺病毒轉(zhuǎn)染D2S基因聯(lián)合溴隱亭藥物干預(yù)48h后，相差顯微鏡下見細(xì)胞山現(xiàn)皺縮脫落、胞內(nèi)空泡等明顯的形態(tài)變化，CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞吸光度值發(fā)現(xiàn):pAd-D2S-EGFP轉(zhuǎn)染聯(lián)合溴隱亭治療組的NFPA細(xì)胞存活率明顯降低(40.24±5.26)％，空載體加藥組(90.46±9.08)％及單純加藥組(97.00±5.14)％相比，具有明顯差異。
　　 5、腺病毒轉(zhuǎn)染D2S基因聯(lián)合溴隱

7、亭藥物干預(yù)48h后，熒光顯微鏡結(jié)合Hoechst核染色觀察到大量凋亡細(xì)胞核碎片形成。
　　 結(jié)論:腺病毒可作為垂體腺瘤基因治療研究的載體，其重組腺病毒pAd-D2S-EGFP對(duì)原代培養(yǎng)的人NFPA細(xì)胞具有較好的親噬性;其攜帶的D2S基因所編碼的D2S蛋白，是溴隱亭等多巴胺受體激動(dòng)劑類藥物高效的作用位點(diǎn)。通過腺病毒載體向體外培養(yǎng)的NFPA細(xì)胞高效導(dǎo)入D2S基因使細(xì)胞D2S蛋白表達(dá)水平的上凋，可有效地提高人NFPA細(xì)胞對(duì)溴隱亭治療的