豚鼠糖尿病模型的建立和細(xì)胞外鉀離子濃度對(duì)糖尿病豚鼠乳頭肌動(dòng)作電位的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、糖尿病作為常見的代謝性疾病，可引起心律失常，心肌肥厚，心衰等心血管疾病。而這些疾病的發(fā)生都與心肌細(xì)胞膜上離子通道的重構(gòu)有關(guān)。用四氧嘧啶制備的家兔糖尿病模型，出現(xiàn)QT延長，動(dòng)作電位時(shí)程（APD）延長，與心肌細(xì)胞的主要復(fù)極電流的密度降低有關(guān)，而主要的復(fù)極電流為快速延遲整流性鉀離子通道電流(Ikr)和緩慢延遲整流性鉀離子通道電流(Iks)，Ikr通道蛋白由hERG基因編碼，而Iks通道主要由KCNQ1形成的α亞基和KCNE1形成的β亞基組成。

2、當(dāng)復(fù)極電流Ikr和Iks電流密度降低后可使QT和APD延長。本研究旨在觀察實(shí)驗(yàn)性糖尿病豚鼠乳頭肌動(dòng)作電位的變化及不同濃度的鉀離子對(duì)糖尿病豚鼠和正常豚鼠乳頭肌動(dòng)作電位的影響并分析其機(jī)制。
　　 第一部分豚鼠糖尿病模型的建立
　　 目的:制備豚鼠糖尿病模型。
　　 方法:雄性豚鼠20只，體重250-350g，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為2組，對(duì)照組和模型組，每組10只，造模前所有豚鼠饑餓12hr。模型組豚鼠快速靜脈

3、注射200mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)的枸櫞酸緩沖液，對(duì)照組注射相同劑量的枸櫞酸緩沖液。分別于給藥當(dāng)天（第0天）及給藥后第2、7、14天稱量體重，并自耳緣靜脈取血測(cè)量血糖濃度;于給藥后14天取各組動(dòng)物胰腺組織，HE染色后進(jìn)行病理學(xué)觀察;采用細(xì)胞內(nèi)玻璃微電極記錄的方法觀察模型組豚鼠乳頭肌動(dòng)作電位的變化;采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)模型組豚鼠心肌組織KCNQ1、ERGRNA的變化。
　　 結(jié)果:(1)模型組豚鼠出現(xiàn)毛色發(fā)暗，身體消瘦

4、，多飲多尿等癥狀，且有4只豚鼠相繼死亡，而對(duì)照組動(dòng)物未見上述表現(xiàn)且全部存活。與對(duì)照組相比，給藥后第2天，7天，14天模型組豚鼠體重明顯減輕(p＜0.01)。(2)給藥后第2天，與對(duì)照組(6.4±0.6mmol/L)相比，模型組血糖(17.4±1.4mmol/L)明顯增加(p＜0.01)，給藥后第7天模型組血糖(8.6±1.7mmol/L)與第2天相比有所降低，但與對(duì)照組(6.4±0.8mmol/L)相比仍明顯增加(p＜0.01)，第14

5、天模型組血糖逐漸恢復(fù)，與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。(3)模型組豚鼠胰島細(xì)胞受損，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，呈玻璃樣變。(4)與對(duì)照組(102±12ms)相比，模型組APD30（84±8ms）明顯縮短(p＜0.05);與對(duì)照組(206±6ms)相比，模型組APD90（168±2ms）明顯縮短(p＜0.01);與對(duì)照組(104±11ms)相比，模型組APD90-30(84±6ms)明顯縮短(p＜0.01);與對(duì)照組(20±2v/s)相

6、比，模型組Vmax(16±1v/s)明顯減慢(p＜0.01)。(5)與對(duì)照組豚鼠心肌ERGRNA(19.63±0.66)相比，模型組豚鼠心肌ERGRNA(5.29±0.15)明顯增加(P＜0.01);與對(duì)照組豚鼠心肌KCNQ1RNA(3.48±0.08)相比，模型組豚鼠心肌KCNQ1RNA(1.17±0.05)明顯增加(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:豚鼠快速靜脈注射200mg/kg鏈脲佐菌素后，血糖出現(xiàn)可逆性短暫升高。同時(shí)出現(xiàn)體

7、重減輕、多飲多尿的癥狀，與臨床Ⅰ型糖尿病相似。此外出現(xiàn)胰島損傷，APD縮短。因此制備得到豚鼠病理性糖尿病模型。
　　 第二部分細(xì)胞外鉀離子濃度對(duì)糖尿病豚鼠乳頭肌動(dòng)作電位的影響及其機(jī)制的研究
　　 目的:觀察不同濃度K+對(duì)正常豚鼠和糖尿病豚鼠乳頭肌細(xì)胞AP的影響并分析其機(jī)制。
　　 方法:采用玻璃微電極細(xì)胞內(nèi)記錄的方法，觀察在1Hz刺激頻率作用下改變灌流液中K+濃度（1mM，10mM，30mM），觀察其對(duì)正常豚鼠和

8、糖尿病豚鼠乳頭肌動(dòng)作電位參數(shù)（APD90，APD30，APD90-30，Vmax，APA）的影響。采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)糖尿病豚鼠心肌組織孵育1mMK+后KCNQ1、ERGRNA的變化。
　　 結(jié)果:(1)1mM鉀離子對(duì)正常豚鼠心肌細(xì)胞AP的影響:與正常臺(tái)氏液APD30(107±5ms)相比，含1mM鉀離子的臺(tái)氏液灌流30min后APD30(91±4ms)明顯減小（P＜0.01）;與正常臺(tái)氏液APD90(191±6ms)相比

9、，含1mM鉀離子的臺(tái)氏液灌流30min后APD90(246±18ms)明顯增大（P＜0.01）;與正常臺(tái)氏液APD90-30(86±5ms)相比，含1mM鉀離子的臺(tái)氏液灌流30min后APD90-30(155±16ms)明顯增大（P＜0.01）;與正常臺(tái)氏液相比，含1mM鉀離子的臺(tái)氏液灌流30min后Vmax和APA無明顯變化（P＞0.05）。(2)1mM鉀離子對(duì)糖尿病豚鼠心肌細(xì)胞AP的影響:與正常臺(tái)氏液APD90(164±8ms)相比

10、，含1mM鉀離子的臺(tái)氏液灌流30min后APD90(224±14ms)明顯延長（P＜0.01）;與正常臺(tái)氏液APD90-30(68±6ms)相比，含1mM鉀離子的臺(tái)氏液灌流30min后APD90-30(121±25ms)明顯增大(P＜0.01);部分乳頭肌細(xì)胞出現(xiàn)早后除極和觸發(fā)活動(dòng)。與正常臺(tái)氏液相比，含1mM鉀離子的臺(tái)氏液灌流30min后APD30、Vmax和APA無明顯變化（P＞0.05）。(3)10mM鉀離子對(duì)正常豚鼠心肌細(xì)胞AP的

11、影響:與正常臺(tái)氏液APD30(100±9ms)相比，含10mM鉀離子的臺(tái)氏液灌流30min后APD30(69±12ms)明顯減小(P＜0.01);與正常臺(tái)氏液APD90(200±8ms)相比，含10mM鉀離子的臺(tái)氏液灌流30min后APD90(141±10ms)明顯減小(P＜0.01);與正常臺(tái)氏液APD90-30(110±12ms)相比，含10mM鉀離子的臺(tái)氏液灌流30min后APD90-30(68±4ms)明顯減?。≒＜0.01）;

12、與正常臺(tái)氏液APA（126±7mV）相比，含10mM鉀離子的臺(tái)氏液灌流30min后APA（109±5mV）明顯減慢(P＜0.01);含10mM鉀離子的臺(tái)氏液灌流前后Vmax無明顯變化（P＞0.05）。(4)10mM鉀離子對(duì)糖尿病豚鼠乳頭肌的AP的影響:給糖尿病豚鼠乳頭肌灌流含10mM鉀離子的臺(tái)氏液30min后APD90（148±11ms）、APD90-APD30（70±5ms）與灌流前APD90（176±6ms）、APD90-APD30

13、（84±7ms）相比明顯減小(P＜0.01);其它指標(biāo)APA、APD30、Vmax在灌流含10mM鉀離子的臺(tái)氏液前后無明顯變化(P＞0.05)。(5)30mM鉀離子對(duì)正常豚鼠心肌細(xì)胞AP的影響:用含30mM鉀離子的臺(tái)氏液灌流30min后APA，APD30，APD90，APD90-30，Vmax與灌流前相比均明顯減?。≒＜0.01）。(6)30mM鉀離子對(duì)糖尿病豚鼠乳頭肌的AP的影響:用含30mM鉀離子的臺(tái)氏液灌流糖尿病豚鼠乳頭肌30mi

14、n后APA，APD30，APD90，APD90-30，Vmax與灌流前相比均明顯減小(P＜0.01)。(7)1mM鉀離子對(duì)糖尿病豚鼠心肌組織中KCNQ1、ERGRNA的影響:用含1mM鉀離子的臺(tái)氏液孵育糖尿病豚鼠心肌組織30min，其KCNQ1、ERGRNA，與糖尿病豚鼠心肌組織相比，明顯增加(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:細(xì)胞外不同濃度K+可改變正常豚鼠和糖尿病豚鼠的AP，低濃度K+(1mM)使正常豚鼠和糖尿病豚鼠APD延長，

15、高濃度K+(10mM)使正常豚鼠和糖尿病豚鼠APD縮短。低濃度K+(1mM)使糖尿病豚鼠心肌細(xì)胞Ikr和Iks電流密度增加，但APD卻縮短。
　　 第三部分細(xì)胞外高濃度葡萄糖對(duì)豚鼠乳頭肌動(dòng)作電位的影響
　　 目的:觀察細(xì)胞外100mM葡萄糖對(duì)正常豚鼠和糖尿病豚鼠乳頭肌動(dòng)作電位的影響。
　　 方法:采用玻璃微電極細(xì)胞內(nèi)記錄的方法，觀察在1Hz刺激頻率作用下改變灌流液中葡萄糖濃度(100mM)，觀察其對(duì)正常豚鼠和糖尿

16、病豚鼠乳頭肌動(dòng)作電位參數(shù)(APD90，APD30，APD90-30，Vmax，APA)的影響。
　　 結(jié)果:(1)100mM葡萄糖對(duì)正常豚鼠乳頭肌細(xì)胞AP的影響:與正常臺(tái)氏液APD90(210±9ms)相比，含100mM葡萄糖的臺(tái)氏液灌流30min后APD90(196±5ms)明顯縮短(P＜0.01);與正常臺(tái)氏液APD390(120±6ms)相比，含100mM葡萄糖的臺(tái)氏液灌流30min后APD30(110±7ms)明顯縮短（

17、P＜0.05）;含100mM葡萄糖的臺(tái)氏液灌流30min后APD90-30、Vmax和APA無明顯變化（P＞0.05）。(2)100mM葡萄糖對(duì)糖尿病豚鼠乳頭肌細(xì)胞AP的影響:與正常臺(tái)氏液APD90(166±4ms)相比，含100mM葡萄糖的臺(tái)氏液灌流30min后APD90(152±5ms)明顯縮短(P＜0.01);100mM葡萄糖灌流30min后，APA，APD30，APD90-30，Vmax與灌流前比較，均無顯著性差異（P＞0.05