人參皂甙Rg1對百草枯誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson's disease, PD)是常見的老年神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以中腦黑質(zhì)致密帶多巴胺(Dopamine, DA)能神經(jīng)元變性、丟失及支配紋狀體神經(jīng)的DA 水平的下降為主要特征。其致病因素及潛在發(fā)病機(jī)制還不明確，內(nèi)源性和外源性神經(jīng)毒素的損害部分說明這一發(fā)病過程。多項(xiàng)證據(jù)表明，環(huán)境中的殺蟲劑、金屬、碳?xì)浠衔锏缺灰蔀閰⑷隤D 發(fā)病的起始階段。 百草枯(1,1，-dimethyl-4,4，-bypiridi

2、nium, Parquat, PQ)是一種廣泛使用的非選擇性的除草劑，它與已知神經(jīng)毒物1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP) 的活性代謝產(chǎn)物1-甲基-4-苯基-吡啶(1-methyl-4-pheny1-pyridium, MPP+) 的化學(xué)結(jié)構(gòu)極其相似，這種結(jié)構(gòu)的相似性預(yù)示了它可能是PD的病原學(xué)潛在因素之一。大量流行病學(xué)研究顯示

3、長期接觸PQ明顯增加了PD的發(fā)病危險(xiǎn)。研究發(fā)現(xiàn)PQ選擇性的破壞實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的黑質(zhì)紋狀體DA能神經(jīng)元。 人參皂甙是來源于人參根部的藥理活性成分。研究發(fā)現(xiàn)：通過提高膽堿能神經(jīng)活力，人參皂甙Rg1 和Rb1 均可以逆轉(zhuǎn)東莨菪堿誘導(dǎo)的健忘癥，發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用。其中人參皂甙Rg1 還具有提高免疫力，延緩衰老等功效，其神經(jīng)保護(hù)作用日益受到人們的關(guān)注。PC12 細(xì)胞來源于大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞，具有與DA 能神經(jīng)元的合成物、轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的類似

4、特征。而且，PC12 細(xì)胞合成的遞質(zhì)、表達(dá)的受體接近中腦DA 能神經(jīng)元，是DA 能神經(jīng)元體外研究理想模型。然而，人參皂甙Rg1 對PQ 誘導(dǎo)的DA 能神經(jīng)元的損傷是否具有保護(hù)作用，目前尚未見報(bào)道。 在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們利用PQ 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞的損傷作為PD 的體外模型來研究人參皂甙Rg1 可能的神經(jīng)保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)一 目的： 篩選出PQ 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷的有效濃度、時(shí)間及人參皂甙Rg

5、1 對該濃度PQ 損傷PC12 細(xì)胞的有效保護(hù)濃度。方法：PQ 損傷作用設(shè)空白對照組及100、200、400、600、800、1000 μmol/L 六個(gè)PQ 濃度組，各濃度設(shè)12、24、36、48 h 四個(gè)干預(yù)時(shí)間。人參皂甙Rg1 保護(hù)作用設(shè)空白對照組、PQ 組(終濃度800 μmol/L)、預(yù)處理組：加PQ(終濃度800 μmol/L)前分別加入濃度為5、10、20 μmol/L 的人參皂甙Rg1 預(yù)孵育24 h。采用MTT 比色法

6、和乳酸脫氫酶(LDH)釋放量測定法對各濃度進(jìn)行篩選。 結(jié)果： 經(jīng)MTT 比色法檢測，PQ 對PC12 細(xì)胞具有損傷作用，其誘導(dǎo)的細(xì)胞活力的降低具有劑量和時(shí)間依賴性。與空白對照組相比，800 μmol/L PQ 處理24 h后細(xì)胞活力為44.8 ± 6.9％(P<0.05)。而經(jīng)不同濃度的人參皂甙Rg1 預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)5、10、20 μmol/L 人參皂甙Rg1 預(yù)處理組與PQ 組(49.5 ± 4.2％)相比，可減少細(xì)胞

7、損傷，細(xì)胞活力分別上升為55.7 ± 2.8％、71.2 ± 3.8％、84.4 ± 3.2％(P<0.05)?？瞻讓φ战MLDH(單位為：U/mg prot)的釋放量為89.5± 3.1，PQ 組LDH 釋放量明顯增高為180.9±3.8(與空白對照組相比P<0.05)，人參皂甙Rg1(5、10、20 μmol/L)保護(hù)組抑制了PQ 所引起的LDH 釋放量的升高(分別為160.8 ± 3.8、145.8 ± 4.4、118.3 ± 4.

8、0，與PQ 組相比P<0.05)。 結(jié)論： PQ 對PC12 細(xì)胞具有損傷作用，且這種損傷具有劑量和時(shí)間依賴性；人參皂甙Rg1 對PQ 所引起的PC12 細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。 實(shí)驗(yàn)二 目的： 探討人參皂甙Rg1 對PQ 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞凋亡的影響。方法： MTT 比色試驗(yàn)檢測細(xì)胞活性；FCM 檢測細(xì)胞凋亡比例；Hoechst 33258 染色觀察細(xì)胞核形態(tài)的改變。 結(jié)果：

9、 MTT 法檢測顯示，5、10、20 μmol/L 人參皂甙Rg1可抑制800 μmol/L PQ 作用24 h所誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活性的降低，與PQ組(46.4 ± 3.6％)相比，人參皂甙Rg1預(yù)處理后細(xì)胞活力分別上升為53.6± 3.3％、73.2 ± 3.1％、82.2 ± 2.6％(P<0.05)；FCM 結(jié)果顯示，PQ 處理后，凋亡細(xì)胞的比例(48.9％)與空白對照組(12.8％)相比是增加的，而經(jīng)5、10、20 μmol

10、/L 人參皂甙Rg1 預(yù)處理后，凋亡細(xì)胞比例分別降至39.8％，20.1％，12.3％；正常細(xì)胞核經(jīng)Hoechst 33258 染色后顯示為較大的圓形，形態(tài)規(guī)則，染色均勻彌散。經(jīng)PQ 處理24 h 后，多數(shù)細(xì)胞顯示胞核凝集，且可見DNA熒光碎片。與PQ 組相比，5、10、20 μmol/L 人參皂甙Rg1 預(yù)處理可抑制PQ 誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，顯著減少胞核凝集。 結(jié)論： 人參皂甙Rg1 可抑制PQ誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞調(diào)亡。

11、 實(shí)驗(yàn)三 目的： 探討人參皂甙Rg1 對PQ 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷的抗氧化作用機(jī)制。 方法： 比色法進(jìn)行谷胱甘肽還原酶(GSH)、超(過)氧化物歧化酶(SOD)的活性測定。 結(jié)果： PQ 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞，SOD、GSH(單位均為：U/mg prot)活性較空白對照組有顯著的下降(SOD 的活性從130.51 ± 5.99 下降到53.12 ± 2.67，GSH 的活性從107

12、.87 ± 4.84 下降到49.50 ± 2.54, 與空白對照組相比P<0.05)。使用5、10、20 μmol/L 人參皂甙Rg1 預(yù)處理后，SOD、GSH 活性同PQ 組相比有顯著的升高(SOD 的活性分別為80.58 ± 3.36、105.08 ± 4.92、118.35 ± 3.69；GSH 的活性分別為61.53 ± 3.90、72.90 ± 4.32、87.39 ± 4.54，與PQ 組相比P<0.05)。 結(jié)論

13、： 人參皂甙Rg1 可明顯抑制PQ誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞SOD、GSH 的活性的下降，從而表現(xiàn)較強(qiáng)的抗氧化活性。 實(shí)驗(yàn)四 目的： 探討人參皂甙Rg1 對PQ誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞調(diào)亡作用機(jī)制。 方法： Rh123 染色檢測細(xì)胞線粒體膜電位(MMP)；Caspase-3 活性檢測；免疫細(xì)胞化學(xué)染色測Cyt C、Bcl-2 表達(dá)；Western blotting方法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax

14、表達(dá)。 結(jié)果： Rh123 染色表明空白對照組細(xì)胞線粒體顯示明亮綠色，熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，表現(xiàn)較高的膜電位水平。PQ作用24 h后，Rh123 染色熒光強(qiáng)度明顯減弱，表明細(xì)胞MMP顯著下降。分別加入5、10、20 μmol/L人參皂甙Rg1 后，與PQ組相比熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，MMP顯著提高；PQ組Caspase-3(單位為：pmol.min-1.mg-1)活性顯著增強(qiáng)(與空白對照組相比P<0.001)，與PQ組(1600.6 ±

15、55.7)相比，經(jīng)人參皂甙Rg1 預(yù)處理后，Caspase-3 活性分別降至1219.7 ± 28.7、1083.8 ± 82.7、925.0 ± 29.1(P<0.001)；免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示正常組細(xì)胞形態(tài)良好，Cyt C、Bcl-2 的免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈淡棕黃色，均勻分布于胞質(zhì)及突起內(nèi)。PQ處理后部分細(xì)胞變圓，皺縮，Cyt C在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)增強(qiáng)，染色呈深棕黃色。PC12 細(xì)胞的Bcl-2 表達(dá)應(yīng)激、代償性增強(qiáng)，染色細(xì)胞呈深棕黃色，陽

16、性染色分布于胞質(zhì)和突起中，著色細(xì)胞數(shù)目多。人參皂甙Rg1 預(yù)處理組的Cyt C免疫細(xì)胞化學(xué)染色明顯減弱，而Bcl-2 得到表達(dá)增加，細(xì)胞著色進(jìn)一步加深，細(xì)胞形態(tài)也有改善。PQ組細(xì)胞Cyt C表達(dá)呈陽性細(xì)胞數(shù)(50.3％ ± 1.6％)明顯增多，5、10、20 μmol/L人參皂甙Rg1 預(yù)處理則明顯減少Cyt C表達(dá)呈陽性細(xì)胞數(shù)(44.9 ± 3.5％、42.0 ± 2.6％、28.0 ±2.1％)，較PQ誘導(dǎo)組下降明顯(P<0.05)

17、； Western blotting檢測Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)，結(jié)果表明PQ處理后胞漿內(nèi)Bcl-2、Bax表達(dá)增加。人參皂甙Rg1 預(yù)處理后Bcl-2 表達(dá)進(jìn)一步增加，而Bax的表達(dá)減少，同時(shí)，Bax/Bcl-2 的比率顯著降低。 結(jié)論： 人參皂甙Rg1 對PQ誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用；機(jī)制可能與其抑制PQ引起的細(xì)胞MMP下降，Caspase-3 激活，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Cyt C及Bcl-2、Bax在胞漿