仿生納米纖維HAp-CTS對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化作用研究.pdf

1、用可降解的生物材料支架復(fù)合細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)臈l件下構(gòu)建和修復(fù)缺損骨組織是目前組織工程再生醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是存在于骨髓網(wǎng)狀間質(zhì)內(nèi)的非造血干細(xì)胞，它具有容易分離，易擴(kuò)增，可向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多向分化，且免疫原性較弱等優(yōu)點(diǎn)，是組織工程中廣泛使用的干細(xì)胞類(lèi)型。但是，如何在體內(nèi)、體外環(huán)境下誘導(dǎo)形成特異組織細(xì)胞仍是一個(gè)關(guān)鍵?？紤]到天然條件下正是干細(xì)胞賴(lài)以生存的微環(huán)境(niche)直接調(diào)控著細(xì)胞的各種行

2、為，如何設(shè)計(jì)和研發(fā)出能精確仿生干細(xì)胞生存微環(huán)境的生物材料支架來(lái)誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化，將是在本質(zhì)上實(shí)現(xiàn)有效調(diào)控干細(xì)胞行為的一個(gè)重要研究和努力方向。
　　 天然骨的組成和結(jié)構(gòu)在納米尺度上是基于羥基磷灰石(hydroxyapatite，HAp)和膠原的復(fù)合材料納米纖維結(jié)構(gòu)?；谶@一認(rèn)識(shí)，過(guò)去幾年中，采用電紡絲(electrospinning)方法制備無(wú)機(jī)-有機(jī)混雜的復(fù)合材料納米纖維支架，從而仿生天然骨的超微結(jié)構(gòu)已在骨組織工程研究中受到愈來(lái)

3、愈多的關(guān)注。許多研究結(jié)果表明，仿生復(fù)合材料納米纖維支架對(duì)干細(xì)胞的分化和調(diào)控有良好的促進(jìn)作用。殼聚糖(chitosan，CTS)是一種天然生物大分子材料，殼聚糖的眾多優(yōu)點(diǎn)使其已成為一種常用的骨組織工程支架構(gòu)建的基體材料。盡管前期已有研究表明，電紡羥基磷灰石/殼聚糖(HAp/CTS)復(fù)合材料納米纖維具有明顯的刺激成骨體細(xì)胞的增殖和生物礦化作用，探究仿生HAp/CTS復(fù)合納米纖維對(duì)干細(xì)胞的成骨分化潛能的研究工作則還未見(jiàn)報(bào)道。為此，本論文的主要

4、目的是通過(guò)合成和制備HAp/CTS仿生復(fù)合材料納米纖維，研究其在加成骨誘導(dǎo)劑和不加成骨誘導(dǎo)劑兩種情況下對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用和功效。
　　 本文首先用原位共沉淀的方法合成了羥基磷灰石在殼聚糖基體中占有不同比例的HAp/CTS納米復(fù)合材料。掃描電鏡(SEM)形貌觀察顯示，HAp納米顆粒在CTS中分散均勻；傅立葉變換紅外線(xiàn)光譜(FTIR)分析表明兩種成分之間存在分子間相互作用；X-射線(xiàn)衍射法(XRD)分析了材料的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，復(fù)合

5、物中出現(xiàn)兩種物質(zhì)特征峰，并且隨著HAp含量的減少，HAp的特征峰逐漸減弱，進(jìn)一步提示了羥基磷灰石和殼聚糖之間的相互作用；熱重分析(TG)結(jié)果顯示，與純的殼聚糖比較，HAp/CTS復(fù)合材料的熱穩(wěn)定性提高約30℃，但隨著殼聚糖含量增多，熱損失質(zhì)量增大。
　　 接著用靜電紡的方法將羥基磷灰石占有不同比例的HAp/CTS復(fù)合材料制備成了相應(yīng)的納米纖維。通過(guò)大量的前期試驗(yàn)摸索，發(fā)現(xiàn)當(dāng)不同質(zhì)量比的HAp/CTS復(fù)合材料和純的CTS中加15％

6、的超高分子量聚環(huán)氧乙烷(PEO)后，在濕度為22-25%的條件下，能紡出直徑非常均勻、不帶珠子的形貌很好的納米纖維。用掃描電鏡(SEM)和場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(FESEM)分析了電紡法制備的相應(yīng)納米纖維的形貌。紅外光譜(FTIR)和X-射線(xiàn)衍射(XRD)分析都表明HAp/CTS復(fù)合材料在電紡成納米纖維后兩物質(zhì)間仍存在相互作用。熱重分析(TG)的結(jié)果顯示，與純的殼聚糖納米纖維比較，復(fù)合材料納米纖維的熱穩(wěn)定性也提高了30℃。
　　 最后，

7、采用小鼠多潛能干細(xì)胞系C3H10T1/2，我們研究了HAp/CTS(30:70，w/w)仿生復(fù)合納米纖維對(duì)mMSCs向成骨細(xì)胞分化的影響。細(xì)胞的SEM和增殖實(shí)驗(yàn)分別表明，細(xì)胞在仿生HAp/CTS復(fù)合材料納米纖維支架上比在CTS納米纖維支架上有更好的黏附、鋪展和增殖能力。在不加任何誘導(dǎo)劑的情況下，基因水平骨相關(guān)基因(ColI，Runx2，ALP和OCN)的檢測(cè)和蛋白質(zhì)水平標(biāo)志蛋白堿性磷酸酶(ALP)和膠原的檢測(cè)都一致性地證明，仿生HAp/

8、CTS復(fù)合材料納米纖維支架可顯著地促進(jìn)mMSCs的成骨分化能力。而加誘導(dǎo)劑的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，該仿生復(fù)合材料納米纖維支架能與常用的成骨誘導(dǎo)劑共效促進(jìn)mMSCs的成骨分化。
　　 總之，我們當(dāng)前的研究結(jié)果表明，仿生HAp/CTS復(fù)合材料納米纖維支架能明顯地促進(jìn)C3H10T1/2干細(xì)胞的粘附、增殖和分化，這為今后進(jìn)一步探究其在動(dòng)物體內(nèi)的成骨和修復(fù)缺損的功效提供了有力的數(shù)據(jù)支持。結(jié)合基于該材料的前期研究結(jié)果，有理由相信，仿生HAp/CTS