腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子CD82-KAII1與神經(jīng)節(jié)苷脂協(xié)同抑制腫瘤轉(zhuǎn)移分子機制的研究.pdf

1、CD82/KAI1是四跨膜蛋白家族（tetraspanin superfamily）的重要成員之一。其主要生物學(xué)功能是參與細胞運動、遷移的調(diào)節(jié)。CD82廣泛表達于各種正常的組織細胞，在腫瘤組織表達降低或不表達。最初研究發(fā)現(xiàn)CD82是前列腺癌特異的轉(zhuǎn)移抑制因子。后來大量的實驗結(jié)果表明，在各種不同組織來源的腫瘤，CD82均可抑制其細胞的轉(zhuǎn)移。CD82可抑制體外培養(yǎng)的腫瘤細胞的運動遷移能力，抑制動物模型瘤細胞的轉(zhuǎn)移，臨床上多種腫瘤的惡性程度及

2、轉(zhuǎn)移能力（尤其是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力）與CD82蛋白的表達成負相關(guān)，檢測CD82蛋白的表達可做為判斷腫瘤是否轉(zhuǎn)移及預(yù)后的重要指標(biāo)。因此，CD82被認為是廣譜的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子(wide-spectruminvasion-and metastasis-suppressor)。
　　自從1995年CD82的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制能力被首次報道以來，對其作用機制進行了不斷的探索，其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的機制正逐步被揭示。CD82抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移主要通過兩條途

3、經(jīng)來實現(xiàn)。一是直接與一些細胞表面黏附分子如整合素（integrin）、膜結(jié)合型免疫球蛋白(mIgG)等相互作用，影響細胞的浸潤及運動遷移能力。二是直接或間接作用于一些細胞質(zhì)膜受體如生長因子受體等，影響其介導(dǎo)的信號跨膜傳遞，從而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)與運動遷移相關(guān)的信號通路。
　　神經(jīng)節(jié)苷脂是分布于各種組織細胞表面的含有唾液酸的鞘糖脂。神經(jīng)節(jié)苷脂主要通過將疏水的神經(jīng)酰胺部分插入脂質(zhì)雙分子層的質(zhì)膜外層而定位于細胞膜上，其寡糖部分則暴露于細胞表面。

4、神經(jīng)節(jié)苷脂雖屬于細胞質(zhì)膜的微量組份，但它能夠與細胞膜上的其它組分如黏附分子、受體等相互作用，參與細胞識別黏附，調(diào)節(jié)受體介導(dǎo)的信號跨膜傳遞從而調(diào)節(jié)細胞分化及運動遷移能力等。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，CD82的轉(zhuǎn)移抑制作用與神經(jīng)節(jié)苷脂，尤其是GM2和GM3的關(guān)系十分密切。大量的研究表明，CD82與神經(jīng)節(jié)苷脂對多種組織來源的腫瘤轉(zhuǎn)移有協(xié)同抑制作用。如GM3與CD9對腫瘤轉(zhuǎn)移可發(fā)揮協(xié)同抑制作用。GM2與CD82對腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制能力遠大于二者的單獨作用。

5、GM2和GM3共同與CD82可發(fā)揮最大的協(xié)同抑制效應(yīng)。目前，對CD82與神經(jīng)節(jié)苷脂協(xié)同作用機理知之甚少。研究發(fā)現(xiàn)，在細胞表面，CD82常與神經(jīng)節(jié)苷脂或其它四跨膜家族蛋白簇集分布在特定功能的膜微區(qū)，并募集一些膜分子如生長因子受體、整合蛋白、肌醇3激酶、PKC等形成特定功能的膜蛋白復(fù)合體（Tetraspanin Web）。CD82抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用有賴于Tetraspanin Web的形成。抑制Tetraspanin Web的形成，CD82

6、失去轉(zhuǎn)移抑制的作用。因此，弄清楚CD82與神經(jīng)節(jié)苷脂協(xié)同作用機理，以及Tetraspanin Web形成機制，對最終徹底闡明CD82抑制腫瘤轉(zhuǎn)移分子機理是十分重要的。弄清這一問題，首先要了解CD82與神經(jīng)節(jié)苷脂以及其他組成Tetraspanin Web分子之間相互識別、相互作用的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　CD82是跨膜糖蛋白，其胞外區(qū)有三個可N-糖基化的位點(Asn129，Asn157和Asn198)。將這些糖基化位點定點突變后，CD8

7、2抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用減弱或消失。提示N-糖鏈對CD82發(fā)揮抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用是必需的。已知糖鏈的重要作用之一是參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-鞘糖脂之間的識別、粘連。因此，N-糖鏈可能做為CD82與神經(jīng)節(jié)苷脂及其他分子相互作用的重要結(jié)構(gòu)。
　　在本課題研究工作中，為探討神經(jīng)節(jié)苷脂與CD82協(xié)同抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機理，我們進行了以下幾個內(nèi)容的研究。
　　一.神經(jīng)節(jié)苷脂GM2/GM3對腫瘤細胞體外運動遷移能力的影響及可能作用機理的研究。

8、采用不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力的小鼠腹水型肝癌細胞株做為模型（淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移肝癌細胞株HCa-F和低轉(zhuǎn)移株HCa-P），比較了兩細胞株神經(jīng)節(jié)苷脂的表達。我們發(fā)現(xiàn)兩細胞株神經(jīng)節(jié)苷脂組份有顯著的差異:低轉(zhuǎn)移的Hca-F細胞神經(jīng)節(jié)苷脂以較簡單的GM3為主（約占80％）。而高轉(zhuǎn)移的Hca-P細胞神經(jīng)節(jié)苷脂以GM2為主（約占70％），并含有較多的結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的神經(jīng)節(jié)苷脂GM1、GD1等。提示神經(jīng)節(jié)苷脂的差異性表達可能牽涉到兩細胞株淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移的能力。為此，我們

9、對GM3影響兩細胞株淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移能力的分子機制做了進一步的研究。我們用特異的神經(jīng)節(jié)苷脂合成抑制劑(PPPP)處理低轉(zhuǎn)移的Hca-P細胞，下調(diào)Hca-P細胞GM3的表達;同時用外源性GM3處理高轉(zhuǎn)移的Hca—F細胞，以上調(diào)Hca—F細胞GM3的表達，然后采用Boyden小室培養(yǎng)和Western bloting技術(shù)，分別觀察了GM3對兩細胞株表皮生長因子受體(EGFR)的磷酸化活化、細胞內(nèi)與轉(zhuǎn)移相關(guān)的PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性，以及兩

10、細胞株細胞的體外遷移能力的影響。
　　結(jié)果:(1)神經(jīng)節(jié)苷脂合成抑制劑(PPPP)下調(diào)低轉(zhuǎn)移的Hca-P細胞神經(jīng)節(jié)苷脂的合成（下調(diào)GM3的表達），可促進細胞體外運動遷移;但同樣下調(diào)高轉(zhuǎn)移的Hca-F細胞神經(jīng)節(jié)苷脂的合成（下調(diào)GM2的表達），則不影響其體外運動遷移。說明是GM3而不是GM2可影響細胞體外運動遷移，GM3的作用是抑制細胞的運動遷移。(2)下調(diào)低轉(zhuǎn)移的Hca-P細胞神經(jīng)節(jié)苷脂的合成（下調(diào)GM3的表達），可促進EGFR的1

11、173酪氨酸殘基磷酸化及PKB/Akt的絲氨酸473、蘇氨酸308殘基磷酸化;增加外源性GM3，上調(diào)高轉(zhuǎn)移的Hca—F細胞GM3含量，可抑制EGFR的1173酪氨酸殘基磷酸化及PKB/Akt的絲氨酸473、蘇氨酸308殘基磷酸化，說明GM3可抑制EGFR的活化，下調(diào)PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。這可能是GM3抑制細胞的運動遷移的機制之一。(3)采用PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制劑阻斷PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可抑制細胞的遷移運動能力。說明PI3K信號轉(zhuǎn)

12、導(dǎo)通路是調(diào)節(jié)細胞遷移運動能力的細胞內(nèi)主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　結(jié)論:(1) GM3是影響兩細胞株細胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力的重要因素之一，其作用是抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。(2) GM3抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能分子機制之一是抑制EGFR自身磷酸化活化，下調(diào)細胞內(nèi)PI3K/AKT信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性。
　　二.神經(jīng)節(jié)苷脂與CD82協(xié)同抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機理的研究。
　　我們采用人淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌SW620細胞株為模型，對神經(jīng)節(jié)苷脂與CD82協(xié)

13、同抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機理進行了研究。SW620細胞株幾乎無CD82表達，GM2是其主要神經(jīng)節(jié)苷脂組分。我們采用神經(jīng)節(jié)苷脂合成抑制劑(PPPP)或添加外源性神經(jīng)節(jié)苷脂以改變神經(jīng)節(jié)苷脂含量，或采用分子生物學(xué)技術(shù)轉(zhuǎn)染CD82基因使其過表達，然后采用Boyden小室培養(yǎng)和Western bloting技術(shù)，分別觀察了GM3和CD82不同處理條件下SW620細胞體外遷移能力、表皮生長因子受體(EGFR)的磷酸化活化、細胞內(nèi)與轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

14、PI3K/AKT、MAPK和PLCγ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性影響。
　　結(jié)果:(1) GM3抑制EGFR刺激的SW620細胞體外遷移運動，同時抑制EGFR的酪氨酸1173殘基和PKB/Akt的絲氨酸473殘基磷酸化;GM2對細胞遷移、EGFR和PKB/Akt磷酸化均無影響。(2) CD82過表達抑制EGFR刺激的SW620細胞體外的遷移運動，同時抑制EGFR的酪氨酸1045殘基和ERK的磷酸化。(3) GM3和GM2均可增強CD82對SW

15、620細胞體外遷移運動的抑制作用，但GM3增強CD82對EGFR酪氨酸殘基1173和Akt磷酸化的抑制作用，GM2增強CD82對EGFR酪氨酸殘基1045和Erk磷酸化的抑制作用。(4) GM3和GM2共同與CD82作用可對細胞遷移產(chǎn)生最大的協(xié)同抑制效應(yīng)，同時抑制EGFR的1173酪氨酸殘基、1045位酪氨酸殘基磷酸化，和Akt、Erk的磷酸化。說明GM3和GM2與CD82產(chǎn)生最大協(xié)同抑制效應(yīng)可能是同時抑制EGFR的1173酪氨酸殘基、

16、1045位酪氨酸殘基磷酸化，同時下調(diào)細胞內(nèi)和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性的結(jié)果。
　　結(jié)論:(1) GM3單獨可抑制EGFR刺激的SW620細胞體外遷移運動，其原理是抑制EGFR的酪氨酸1173殘基磷酸化及活化，下調(diào)細胞內(nèi)PI3K/AktK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而GM2則無作用。(2) CD82單獨也可抑制EGFR刺激的SW620細胞體外遷移運動，但其原理是抑制EGFR的酪氨酸1045殘基磷酸化及活化，下調(diào)細胞內(nèi)MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。(3)

17、GM3和GM2單獨均可與CD82產(chǎn)生協(xié)同抑制作用，但機理不同。GM3與CD82協(xié)同抑制機理是增強對EGFR酪氨酸殘基1173殘基磷酸化的抑制和下調(diào)細胞內(nèi)PI3K/AktK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。GM2與CD82協(xié)同抑制機理是增強對EGFR酪氨酸殘基1045殘基磷酸化的抑制和下調(diào)細胞內(nèi)MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。說明GM3和GM2分別通過不同的機制與CD82發(fā)揮協(xié)同作用。(4) GM3和GM2共同與CD82作用可對細胞遷移產(chǎn)生最大協(xié)同抑制效應(yīng)，其原理是同

18、時抑制EGFR的1173酪氨酸殘基、1045位酪氨酸殘基磷酸化，同時下調(diào)細胞內(nèi)和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性。
　　三.CD82 N-糖鏈在神經(jīng)節(jié)苷脂與CD82協(xié)同抑制轉(zhuǎn)移中的作用及分子機理的研究。
　　已知細胞表面糖脂及糖蛋白的聚糖糖鏈的重要作用之一是參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-鞘糖脂之間的識別、粘連。為弄清CD82胞外結(jié)構(gòu)N-糖鏈在CD82與神經(jīng)節(jié)苷脂協(xié)同抑制腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用，我們采用基因重組技術(shù)構(gòu)建了攜帶CD82cDNA的

19、重組質(zhì)粒pcDNA4.0-CD82-V5。以此為模型，采用點突變技術(shù)構(gòu)建了不同N-糖基化位點突變的CD82重組質(zhì)粒，將其用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染SW620細胞，觀察不同N-糖基化位點突變的CD82表達產(chǎn)物在細胞亞器的分布，及對細胞體外運動遷移能力的影響。并篩選了穩(wěn)定表達不同突變體的細胞株，對部分突變體在細胞表面脂筏中的分布進行了初步的研究。
　　結(jié)果:(1)構(gòu)建了攜帶CD82 cDNA的重組質(zhì)粒pcDNA4/V5-CD82以及不同N-

20、糖基化位點突變的CD82重組質(zhì)粒，包括Asn129、Asn157、Asn198單位點突，Asn129/Asn157、Asn129/Asn198、Asn157/Asn198雙點突變和Asn129/Asn157/Asn198三點突變的CD82突變體，基因測序證明構(gòu)建成功。(2)細胞組化實驗結(jié)果表明，不同N-糖基化位點突變的CD82突變體在SW620成功表達。除雙點突變Asn157/Asn198和三點突變的Asn129/Asn157/Asn1

21、98的CD82分布在胞內(nèi)，其余突變體均在細胞表面表達。(3) Asn129/Asn157、Asn157/Asn198、Asn129/Asn157/Asn198位點突變可影響CD82對腫瘤細胞體外遷移的抑制作用。(4)篩選了穩(wěn)定表達Asn129/Asn157/Asn198突變體的細胞株，采用超速離心技術(shù)分離細胞膜脂筏，觀察不同N-糖基化位點突變對CD82在脂筏分布的影響。
　　結(jié)論:(1)成功構(gòu)建了不同N-糖基化位點突變的CD82重