裂蹄層孔菌活性分析及其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移分子機(jī)制.pdf

1、裂蹄層孔菌(Phellinus linteus)是一種多年生稀貴藥用真菌，屬多孔菌科(Polyporaceae)。隨著自然環(huán)境的惡化，裂蹄層孔菌藥材資源已成稀缺，如何解決藥材資源也是發(fā)揮裂蹄層孔菌藥用價(jià)值的關(guān)鍵。自古至今裂蹄層孔菌一直應(yīng)用于治療痢疾、出血、腫瘤等疾病，但古代醫(yī)書和民間用藥一直以經(jīng)驗(yàn)作為用藥依據(jù)，對該菌的描述比較籠統(tǒng)，缺乏藥效成分分析和作用機(jī)理的闡述。
　　 本論文通過針對黃酮組分的裂蹄層孔菌發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)

2、化，建立了裂蹄層孔菌藥材大規(guī)模培養(yǎng)的工藝技術(shù)；進(jìn)一步分析了裂蹄層孔菌發(fā)酵產(chǎn)物的化學(xué)成分，得到了一系列化合物，為裂蹄層孔菌發(fā)酵物的現(xiàn)代藥理學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。最后，深入研究了裂蹄層孔菌的活性成分Hispolon的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)Hispolon可以通過抑制ROS/p-ERK/Slug/E-cadherin這一通路抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。主要結(jié)果如下：
　　 1.以裂蹄層孔菌中的黃酮組分為指標(biāo)，對其液體深層發(fā)酵的工藝進(jìn)行了優(yōu)

3、化，得到了較優(yōu)的培養(yǎng)基組成：3％葡萄糖、2％乳糖、1％牛肉膏、0.3％豆餅粉、0.1％ KH2PO4和0.05％ MgSO4，并發(fā)現(xiàn)添加豆餅粉可以明顯增加黃酮的產(chǎn)量，優(yōu)化后的黃酮產(chǎn)量可達(dá)初始培養(yǎng)基的4倍。進(jìn)一步分析表明，發(fā)酵過程中添加豆餅粉可以明顯增加黃酮組分的抗氧化活性，但抗腫瘤活性反而降低。
　　 2.利用現(xiàn)代波譜學(xué)技術(shù)(NMR、MS、HR-MS、IR等)對裂蹄層孔菌的發(fā)酵菌絲和發(fā)酵液的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究分析，共分離鑒定1

4、3個(gè)不同化合物，包括鏈狀倍半萜類新化合物2個(gè)、黃酮類化合物2個(gè)、甾醇類化合物2個(gè)以及其他一些小分子化合物，并對兩種新化合物進(jìn)行了抗腫瘤活性篩選。運(yùn)用GC-MS技術(shù)，對裂蹄層孔菌發(fā)酵菌絲的乙酸乙酯萃取物中的揮發(fā)性成分進(jìn)行系統(tǒng)分析，從中鑒定出12種化合物，包括3種環(huán)二肽類化合物、2種甾醇類化合物、6種多不飽和脂肪酸類化合物，其中環(huán)二肽類化合物為首次從該種真菌中鑒定出來。
　　 3.論文深入研究了裂蹄層孔菌的活性成分Hispolon抑

5、制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。首先我們建立了TPA誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)移的模型，加入誘導(dǎo)劑TPA后，ROS水平在短時(shí)間內(nèi)明顯上升，激活一系列胞外信號激酶如ERK、JNK、p38、AKT等；在該過程中，E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail和Slug的表達(dá)增加，導(dǎo)致E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制，最終引起上皮性標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)減少、伴隨EMT轉(zhuǎn)變，細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力增加。
　　 研究表明，Hispolon首先

6、抑制TPA誘導(dǎo)的胞內(nèi)ROS水平的升高，進(jìn)而抑制胞外信號激酶ERK的磷酸化，再作用于轉(zhuǎn)錄抑制因子Slug使其表達(dá)下降，Slug的減少導(dǎo)致其對E-cadherin基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用減少、E-cadherin蛋白表達(dá)增加，、最終表現(xiàn)為細(xì)胞間的粘附能力增加，抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，從而基本揭示了Hispolon抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。
　　 綜上所述，本論文解決了裂蹄層孔菌這一珍貴藥用真菌的人工資源化問題，系統(tǒng)研究了裂蹄層孔菌的活性成分