組蛋白低乙?；抡{(diào)PIB5PA表達在人黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用及其分子機制.pdf

1、研究背景及目的:黑色素瘤是來源于神經(jīng)嵴黑色素細胞的一種最致命的皮膚惡性腫瘤。由于其惡性程度極高,且易于早期轉移,患者臨床發(fā)現(xiàn)時已喪失手術治療的機會,而且放化療效果普遍不佳,導致其治療難度大。因此,深入了解黑色素瘤的發(fā)病機理和耐藥機制,以尋求針對特異性分子靶點的個體化治療成為目前黑色素瘤治療的熱點。目前研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號通路在70％黑色素瘤中被高度激活,這可能導致了黑色素瘤對化療和一些分子靶向治療如BRAFV600E抑制劑的抵抗

2、。而對于能夠負向調(diào)控該信號通路的多磷酸肌醇-3-磷酸酶PTEN的缺失正是導致PI3K/Akt信號通路在黑色素瘤中高活化的重要原因之一。然而對于與PTEN類似的具有脂質磷酸酶活性的多磷酸肌醇-5-磷酸酶在黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用尚無相關研究報道。本研究旨在通過鑒定一種多磷酸肌醇-5-磷酸酶分子-PIB5PA在黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用并闡明其負向調(diào)控PI3K/Akt信號的分子機制,為黑色素瘤的個體化治療提供一個新的分子靶點,另外通過對P

3、IB5PA在黑色素瘤細胞中下調(diào)表達的表觀遺傳調(diào)控機制的探索,不僅為研究黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展機制提供新的思路,同時對下調(diào)PIB5PA表達的HDAC的鑒定將有益于發(fā)展更特異的HDAC抑制劑抑制黑色素瘤的生長。
　　方法:(1)分別采用免疫組化法、Westernblot以及實時定量PCR檢測黑色素瘤組織芯片、新鮮黑色素瘤原代培養(yǎng)細胞以及黑色素瘤細胞系中PIB5PA,PTEN以及磷酸化Akt的表達水平。(2)選擇兩株極低表達PIB5PA以及

4、Akt高活化的黑色素瘤細胞系ME1007和Mel-FH瞬時轉染PIB5PAcDNA以及建立攜帶可誘導表達PIB5PA基因系統(tǒng)的黑色素瘤亞細胞系(ME1007.PIB5PA和Mel-FH.PIB5PA),采用Westernblot檢測PIB5PA和磷酸化Akt的表達,BrdU細胞增殖試驗和克隆形成試驗檢測細胞增殖,流式細胞術檢測細胞凋亡;通過在正常人黑色素細胞中knockdownPIB5PA以及PTEN,利用軟瓊脂克隆試驗檢測黑色素細胞非

5、貼附性生長情況;通過建立ME1007.PIB5PA細胞的裸鼠荷瘤模型,觀察4-OHT誘導PIB5PA表達對體內(nèi)黑色素瘤生長的影響,明確PIB5PA在黑色素瘤生長中的作用;在此基礎上,通過對過表達或knockdownPIB5PA的細胞同時轉染myr-Akt或AktshRNA,檢測其對PIB5PA抑制細胞增殖和腫瘤生長的逆轉效果,明確PIB5PA抑制黑色素瘤生長的分子機制。(3)通過對PIB5PA和PTEN基因的單獨或雙重轉染,在血清饑餓狀

6、態(tài)下加以EGF誘導,利用Westernblot檢測黑色素瘤細胞中Akt活化水平的改變,以及同時沉默PIB5PA和PTEN基因,利用軟瓊脂克隆試驗檢測正常黑色素細胞的生長情況,以了解PIB5PA和PTEN在調(diào)節(jié)黑色素瘤細胞PI3K/Akt通路中的作用關系。(4)通過對10株黑色素瘤細胞系PIB5PA基因外顯子的測序,實時定量PCR對黑色素瘤細胞PIB5PA基因拷貝數(shù)進行分析,Westernblot和實時定量PCR檢測DNA甲基化抑制劑5-

7、aza以及不同特異性的HDAC抑制劑分別作用黑色素瘤細胞前后PIB5PA的表達水平,初步明確PIB5PA在黑色素瘤下調(diào)表達的原因;通過對特異性HDAC的siRNAknockdown,利用westernblot檢測PIB5PA表達水平的變化確定黑色素瘤細胞中下調(diào)PIB5PA表達的HDAC;通過對PIB5PA基因啟動子區(qū)進行遞增式刪除構建熒光素酶報告基因系統(tǒng),利用雙熒光素酶報告基因檢測和染色質免疫沉淀試驗明確HDAC通過SP1結合于PIB5

8、PA啟動子區(qū)從而影響PIB5PA轉錄表達的分子機制。
　　結果:(1)與正常痣組織和黑色素細胞相比,在黑色素瘤病理組織以及黑色素瘤細胞中PIB5PA的表達是明顯降低或缺失的,且與PTEN的表達呈一定的正關聯(lián)。(2)在黑色素瘤細胞中過表達PIB5PA能降低Akt的活化,抑制黑色素瘤細胞的增殖,而共轉染myr-Akt能逆轉其抑制作用;在正常黑色素細胞中knockdownPIB5PA能抑制Akt的活化,促進黑色素細胞的非貼附性生長,而共

9、轉染AktshRNA卻能逆轉其促進作用;外源性誘導PIB5PA在裸鼠荷瘤試驗中抑制腫瘤的生長,而對ME1007.PIB5PA細胞感染myr-Akt慢病毒顆粒后能逆轉PIB5PA對腫瘤生長的抑制作用。(3)撤除血清后,過表達PIB5PA能在EGF刺激下引起Akt磷酸化水平的一過性增高,而過表達PTEN僅顯示磷酸化Akt的整體水平的降低;在EGF刺激下,對黑色素瘤細胞同時過表達PIB5PA和PTEN能進一步降低Akt的活化水平,而同時在兩株

10、相對高表達PIB5PA的黑色素瘤細胞中同時knockdownPIB5PA和PTEN則引起Akt的進一步激活;相對于在正常黑色素細胞中僅knockdownPIB5PA或PTEN,雙重knockdownPIB5PA和PTEN形成的細胞克隆的體積明顯增大,而細胞克隆數(shù)卻有所減少。(4)盡管基因拷貝數(shù)降低可能造成一部分黑色素瘤細胞(<20%)中PIB5PA的低表達,但是由HDAC2和-3引起的組蛋白低乙?；窃斐珊谏亓黾毎蠵IB5PA下調(diào)表

11、達的一個重要因素。HDAC2和-3能通過結合轉錄因子SP1作用于PIB5PA啟動子區(qū)(-516/-116)進而抑制PIB5PA的轉錄表達。
　　結論:PIB5PA的下調(diào)表達所引起的黑色素瘤中PI3K/Akt信號通路被激活,以及與PTEN的協(xié)同作用,可能是造成黑色素瘤發(fā)生發(fā)展以及對化療產(chǎn)生抵抗的一個重要因素。組蛋白低乙?；种屏薖IB5PA在黑色素瘤細胞中的表達,其主要機制在于HDAC2和-3與轉錄因子Sp1形成轉錄抑制復合體結合于