microRNA-139在肝細(xì)胞肝癌患者中的表達(dá)及其臨床意義.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,全世界每年大概有64萬(wàn)人被初次診斷患有HCC,其中半數(shù)以上是中國(guó)人。在中國(guó),乙型肝炎病毒(HBV)感染導(dǎo)致肝硬化進(jìn)而演變?yōu)镠CC是其發(fā)病率驟升的首要原因,據(jù)二十世紀(jì)90年代統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,HCC已成為中國(guó)腫瘤相關(guān)致死率排名第二位的疾病。肝細(xì)胞肝癌病情進(jìn)展極快,且具有發(fā)病隱匿的特點(diǎn),多數(shù)患者由于在首次診斷HCC時(shí)即已出現(xiàn)了肝內(nèi)或肝外轉(zhuǎn)移,而喪失了接受根治性手術(shù)的機(jī)會(huì);而另外一少部分患者,由于早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷

2、并接受及時(shí)治療而獲得了較長(zhǎng)的生存時(shí)間。因此,肝細(xì)胞肝癌患者的診斷是決定患者治療效果和生存的重要因素。至今為止,多種分子標(biāo)志物用于HCC診斷,然而,它們均存在敏感度低、特異度不足的問(wèn)題,因此尋找肝細(xì)胞肝癌靈敏度好、特異度高的腫瘤標(biāo)志物是目前肝癌研究領(lǐng)域中迫切需要解決的問(wèn)題。
　　MicroRNAs(miRNAs)是一類(lèi)不參與編碼的小RNA分子,其在DNA完成轉(zhuǎn)錄之后的階段對(duì)靶基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié),與人體的生理活動(dòng)和疾病發(fā)生過(guò)程緊密相關(guān),

3、特別是在腫瘤疾病中,miRNA可作為癌基因也可作為抑癌基因調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。MicroRNA在不同種類(lèi)的腫瘤中具有明顯差異的表達(dá)模式,因此將其作為腫瘤診斷標(biāo)志物或預(yù)后判斷指標(biāo)是非常有希望的。
　　本課題希望通過(guò)芯片檢測(cè)、PCR檢測(cè)等方法尋找到一種能夠用于HCC診斷和判斷預(yù)后的分子標(biāo)志物,主要包含以下四個(gè)部分:
　　第一部分:收集病例資料,選擇入組患者
　　方法:使用Epidata3.0建立數(shù)據(jù)庫(kù),收集符合入組標(biāo)準(zhǔn)的

4、肝細(xì)胞肝癌患者及慢性乙型病毒性肝炎患者臨床病歷資料;使用SPSS21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:HCC患者血清AFP值為17.80ng/ml±598.60ng/ml,明顯高于CH組患者平均血清AFP值7.10ng/ml±13.10ng/ml,其間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.007);此外,其它臨床信息差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:血清甲胎蛋白是臨床應(yīng)用最廣的肝細(xì)胞肝癌分子標(biāo)志物之一,其在多數(shù)原發(fā)性HCC患者中明顯增高,但其

5、具敏感度低、特異度不足的缺陷。肝細(xì)胞肝癌患者和慢性乙型病毒性肝炎患者的一般臨床病歷資料相似,具有可比性。
　　第二部分:篩選肝細(xì)胞肝癌microRNA表達(dá)譜,選擇目標(biāo)基因?yàn)閙icroRNA-139
　　方法:應(yīng)用芯片技術(shù)篩選HCC的miRNA表達(dá)譜,經(jīng)分析數(shù)據(jù)和查閱文獻(xiàn)后選擇目標(biāo)miRNA。
　　結(jié)果:芯片檢測(cè)結(jié)果顯示,HCC患者癌組織中表達(dá)量明顯降低的miRNA有:miRNA-139、miRNA-99a、miRNA-

6、27b、miRNA-378a、miRNA-378e及miRNA-30c,而明顯高表達(dá)的有:miRNA-21、miRNA-221、miRNA-148b以及miRNA-186。經(jīng)慎重的商討后,最終選擇microRNA-139為后續(xù)研究的主要對(duì)象。
　　結(jié)論:本課題芯片所獲得的肝細(xì)胞肝癌的miRNA表達(dá)譜與其它已發(fā)表文獻(xiàn)所報(bào)道的表達(dá)譜不盡一致,分析其原因可能是由于個(gè)體病例或個(gè)體樣本間的異質(zhì)性所致,提示我們腫瘤的發(fā)生過(guò)程是由數(shù)目繁多的基因

7、參與并調(diào)控,具有相當(dāng)?shù)膹?fù)雜性和多樣性。MicroRNA-139在多種惡性腫瘤中下調(diào)表達(dá),而在肝細(xì)胞肝癌臨床研究方面尚無(wú)報(bào)道,選其為后續(xù)研究的目標(biāo)基因符合本課題研究目的,具有可行性。
　　第三部分:RT-qPCR檢測(cè)多個(gè)組織及血漿標(biāo)本中microRNA-139表達(dá)量
　　方法:miRNeasy Mini試劑盒提取組織標(biāo)本中總RNA,BLOODmisi試劑盒提取血漿標(biāo)本中總RNA,經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA溶液純度達(dá)標(biāo)準(zhǔn)后,使用R

8、T-qPCR方法檢測(cè)每個(gè)樣本中miRNA-139的表達(dá)量。
　　結(jié)果:相比于癌旁標(biāo)本,miRNA-139在癌標(biāo)本中表達(dá)明顯下調(diào);相比于CH患者的血漿標(biāo)本,microRNA-139在HCC患者血漿中表達(dá)亦下調(diào);相關(guān)分析提示,miRNA-139在肝細(xì)胞肝癌患者癌標(biāo)本中與血漿標(biāo)本中的表達(dá)水平具有正相關(guān)性。
　　結(jié)論:microRNA-139在肝細(xì)胞肝癌中下調(diào)表達(dá),同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道其在其它多種癌癥中亦有同樣的表現(xiàn),因此我們認(rèn)為miRN

9、A-139下調(diào)表達(dá)是存在于惡性腫瘤中的普遍現(xiàn)象。本部分實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)組織和血漿中miRNA-139表達(dá)量存在正相關(guān)性,出現(xiàn)該結(jié)果的原因眾說(shuō)紛紜,但目前主流的觀點(diǎn)認(rèn)為,循環(huán)血液中的miRNA是由腫瘤相關(guān)微泡或外泌體釋放而來(lái)的,同時(shí),也正是由于微泡或外泌體的保護(hù),使循環(huán)血液中的miRNA免受RNase的降解。
　　第四部分:肝細(xì)胞肝癌患者血漿中microRNA-139的臨床意義
　　方法:基于31名HCC患者的臨床病歷資料及其血漿m

10、iRNA-139的表達(dá)量數(shù)據(jù),使用軟件SPSS21.0統(tǒng)計(jì)分析miRNA-139的臨床意義,當(dāng)相對(duì)應(yīng)的p值小于0.05時(shí)認(rèn)為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:血漿microRNA-139可作為診斷HCC的分子標(biāo)志物,尤其是當(dāng)其與血清AFP聯(lián)合應(yīng)用時(shí),敏感度可達(dá)90.3％、特異度可達(dá)87.1%。根據(jù)31名HCC患者血漿microRNA-139表達(dá)量高低,將≤-3.240的25名HCC患者歸為低表達(dá)組,將>-3.240的6名患者分為高表

11、達(dá)組。統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示:血漿miRNA-139表達(dá)水平與HCC患者的病理E-S分級(jí)、血清AFP值、CEA值及直接膽紅素具有相關(guān)性。此外,短期生存分析提示,miRNA-139低表達(dá)組患者1年生存率為48.0%、中位生存時(shí)間為439天±50天,高表達(dá)組患者1年生存率為66.7%、中位生存時(shí)間為503天±69天,通過(guò)校正患者病理E-S分級(jí)、Child-Pugh分級(jí)、CLIP評(píng)分等因素后,發(fā)現(xiàn)miRNA-139高、低表達(dá)組中患者1年生存率差異具有統(tǒng)

12、計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:miRNA-139單獨(dú)診斷HCC具有較高的敏感度,達(dá)到80%以上,但特異度相對(duì)較低,因此,我們將miRNA-139與AFP聯(lián)合應(yīng)用,使其敏感度和特異度均得到明顯提升。此外,我們發(fā)現(xiàn)miRNA-139表達(dá)水平與病理E-S分級(jí)呈負(fù)相關(guān)性,即miRNA-139表達(dá)水平越低,E-S分級(jí)的級(jí)別越高,而病理E-S分級(jí)隨著腫瘤侵襲性的增強(qiáng)而升高,這也說(shuō)明miRNA-139在肝細(xì)胞肝癌中扮演著保護(hù)性因素的角色。最后的短期生存