Epigallocatechin-3-gallate抑制脂肪生成的作用及機(jī)制.pdf

1、背景與目的：
　　眾所周知，脂肪細(xì)胞有多種生理功能，包括維持能量平衡和分泌脂肪細(xì)胞因子。然而由于能量過多攝入，會(huì)導(dǎo)致脂肪細(xì)胞肥大和增生，特別是內(nèi)臟脂肪細(xì)胞的肥大和增生，將產(chǎn)生出各種病理反應(yīng)，包括肥胖，胰島素抵抗和高血壓等代謝綜合征。一般認(rèn)為，脂肪細(xì)胞來源于前脂肪細(xì)胞，這一過程稱為脂肪細(xì)胞的分化，即脂肪生成。在脂肪生成中，前脂肪細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列形態(tài)與功能的變化，并在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境和基因調(diào)控下，前脂肪細(xì)胞可以分化成為脂肪細(xì)胞。因此，抑制前

2、脂肪細(xì)胞的分化可能成為應(yīng)對(duì)肥胖及其相關(guān)疾病的治療策略之一。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是綠茶的主要成分,具有廣泛的生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗感染、抗癌的作用。然而，很少有人知道其抗脂肪活性的發(fā)生機(jī)制。本研究目的是探討EGCG對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，即前脂肪細(xì)胞（3T3-L1細(xì)胞）分化的影響并探討其可能的機(jī)制。
　　方法：
　　（1）EGCG對(duì)細(xì)胞存活率的作用：將前脂肪細(xì)胞分為五組，分別加入不同濃度的EGCG（10，

3、50，100，200μM），通過MTT法試驗(yàn)評(píng)估EGCG對(duì)3T3-L1細(xì)胞分化時(shí)存活率的影響。
　　（2）EGCG最佳濃度的確定：將3T3-L1細(xì)胞分為五組，分別加入不同濃度的EGCG（10，50，100，200μM），通過油紅O染色觀察EGCG濃度對(duì)3T3-L1細(xì)胞分化作用的影響。
　?。?）EGCG最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定：將3T3-L1細(xì)胞在最佳EGCG誘導(dǎo)濃度下分化2，4，6，8天，再用油紅O染色觀察其脂滴形態(tài)，通過免疫印

4、跡分析法（Western blotting），檢測(cè)過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）和脂肪酸合酶（FAS）的表達(dá)。
　?。?）EGCG通過PI3K-AKT信號(hào)通路抑制脂肪生成的機(jī)制鑒定：實(shí)驗(yàn)分為7組，為:
　?、僬＝M（Control）；
　?、贒MSO組（Vehicle）；
　?、跡GCG組（100μM）；
　?、苷?激活劑（10μM SC-3036或0.5μM SC-79）組；
　?、軪

5、GCG+激活劑（10μM SC-3036或0.5μM SC-79）組；
　　其中SC-3036為PI3K激活劑，SC-79為AKT激活劑，各組細(xì)胞在各自條件下誘導(dǎo)8天。隨后，通過MTT法測(cè)定檢查細(xì)胞活力，通過油紅O染色在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，最后，通過實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）和Western blotting法檢測(cè)mRNA和蛋白質(zhì)水平，包括PPARγ，F(xiàn)AS，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K），AKT和磷酸化AKT(p-AK

6、T)。
　　結(jié)果：
　　（1）MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在10，50，100μM下，細(xì)胞增殖和存活率沒有明顯的變化，而200μM時(shí)，細(xì)胞存活率明顯下降，提示100μM可能是EGCG最佳作用濃度。
　?。?）油紅O染色結(jié)果顯示，隨EGCG濃度的增加，3T3-L1細(xì)胞的脂滴日益減少，并且PPARγ和FAS，無論在mRNA和蛋白質(zhì)水平上，都呈濃度依賴性方式減少，表明3T3-L1細(xì)胞分化的抑制作用與EGCG濃度有關(guān)，100μM為最

7、佳抑制濃度。
　?。?）隨著EGCG處理時(shí)間的延長，脂滴在第2天開始減少，一直持續(xù)至第8天，而且8天后呈顯著性減少，在PPARγ和FAS的表達(dá)水平中，也能觀察到類似的結(jié)果，表明第8天是EGCG最佳誘導(dǎo)時(shí)間。
　?。?）采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE），Western blotting法檢測(cè)各組PPARγ，F(xiàn)AS，PI3K，p-AKT蛋白水平，我們發(fā)現(xiàn)EGCG成劑量和時(shí)間依賴性降低PPARγ與FAS的表達(dá)。隨后，

8、我們?cè)噲D觀察EGCG對(duì)PI3K-AKT信號(hào)通路在3T3-L1細(xì)胞細(xì)胞分化過程中表達(dá)的影響，PI3K和p-AKT的表達(dá)水平呈劑量依賴性降低，而AKT的表達(dá)水平是不明顯的，所以我們可以得出EGCG抑制3T3-L1細(xì)胞分化是通過抑制AKT的活化而不是AKT的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。另有結(jié)果顯示，在DMSO組內(nèi)，與control組相比較，+EGCG組的PPARγ，F(xiàn)AS，PI3K，p-AKT表達(dá)降低。與+EGCG組相比較，EGCG+SC3036組的PPA

9、Rγ，F(xiàn)AS，PI3K，p-AKT表達(dá)增加，EGCG+SC79組的PPARγ，F(xiàn)AS，p-AKT表達(dá)增加。EGCG對(duì)3T3-L1細(xì)胞分化的抑制作用能被SC-3036或SC-79逆轉(zhuǎn)，表明EGCG下調(diào)FAS和PPARγ表達(dá)水平來抑制3T3-L1細(xì)胞的分化是由PI3K-AKT信號(hào)通路介導(dǎo)的。
　　結(jié)論：
　?。?）EGCG呈濃度和時(shí)間依賴方式抑制3T3-L1細(xì)胞的分化；
　?。?）其機(jī)制是EGCG抑制PI3K-AKT信號(hào)通