抑郁大鼠甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和環(huán)磷酰胺藥動學(xué)及CYP450濃度和活性研究.pdf

1、目的:長期以來，臨床藥理學(xué)研究強(qiáng)調(diào)了影響藥物治療的生物學(xué)因素，而忽略了影響藥物治療的社會心理因素。在臨床實踐上我們注意到，心境障礙影響著重大疾病患者藥物治療的全程和效果，但其生物學(xué)作用機(jī)制不明。據(jù)此，本課題旨在通過建立慢性不可預(yù)見性應(yīng)激抑郁大鼠模型，考察臨床常見的抗腫瘤藥物甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）以及環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CP）在抑郁模型大

2、鼠與正常大鼠體內(nèi)藥動學(xué)差異，并比較抑郁模型大鼠與正常大鼠肝組織藥物代謝酶CYP450總酶濃度/活性差異，研究心境障礙對MTX、5-FU和CP在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)是否有影響，探討抑郁心境障礙引起的藥物代謝和藥效與正常心境狀態(tài)下的差異的機(jī)制，期望發(fā)現(xiàn)抑郁心境障礙影響藥物代謝和藥物療效的一般規(guī)律及藥酶基礎(chǔ)上的分子機(jī)制，為構(gòu)建創(chuàng)新的社會心理藥理學(xué)奠定初步的理論和實踐基礎(chǔ)，為臨床藥理學(xué)研究提供一個新思路，最終為指導(dǎo)臨床合理用藥服務(wù)。
　　

3、方法:1.建立抑郁大鼠模型成年Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠54只，體質(zhì)量180±20g，平均分成三批，分別為MTX組、5-FU組和CP組。實驗前大鼠正常飼養(yǎng)一周后，每批大鼠隨機(jī)平均分為抑郁模型組和正常對照組，抑郁模型組大鼠單籠飼養(yǎng)，正常對照組5只一籠群居飼養(yǎng)。抑郁模型組大鼠連續(xù)8周給予慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(chronicunpredictablemildstress，CUMS)，建立抑郁大鼠模型。正常對照組大鼠正常飼養(yǎng)

4、。
　　 2.模型確證根據(jù)抑郁癥的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)理論，分別采用敞箱實驗(Open-fieldtest)和酶聯(lián)免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)測定抑郁模型組和正常對照組大鼠在造模前后的行為學(xué)和血漿中5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)濃度，確證模型建立的成功性。
　　 3.收集血樣及血藥濃度測定抑郁模型建立成功后，抑郁組和對照組大鼠分別按體重尾

5、靜脈注射給予MTX（2mg·kg-1）、5-FU(30mg·kg-1)以及CP（10mg·kg-1），在給藥后不同的時間點眼內(nèi)側(cè)靜脈叢采血，離心，收集血漿樣品，-20℃保存待測。MTX、5-FU和CP采血時間點分別為0.083、0.5、1、2、4、8、12h;0.05、0.083、0.167、0.25、0.5、1、2、4、6h和0.083、0.167、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12h。
　　 4.血藥濃度測定分

6、別采用熒光偏振免疫法(FPIA)、高效液相色譜法(HPLC)和高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS/MS)測定血漿中MTX、5-FU和CP的濃度。采用DAS(DrugandStatistics)2.1版本藥動學(xué)軟件，按二室模型進(jìn)行血藥濃度數(shù)據(jù)分析，計算相關(guān)藥動學(xué)參數(shù)。
　　 HPLC法測定5-FU血漿濃度的色譜條件:色譜柱HypersilODS-C18（4.0×250mm，5μm）;流動相（0.01M醋酸水溶液∶乙腈=99:1

7、，V∶V）;流速(1ml·min-1);紫外檢測波長270nm;柱溫(25℃)。
　　 HPLC-MS/MS法測定CP血漿濃度的色譜條件:色譜柱AgilentZORBAXSB-C18(2.1mm×150mm，5μm);流動相(甲醇:0.1mol·1-1甲酸銨緩沖液=95∶5，V∶V);流速(0.4ml·min-1);柱溫(40℃)。質(zhì)譜條件:電噴霧電離源(ESI)，正離子化，毛細(xì)管電壓4000V，噴霧氣壓力45PSI，干燥氣體流

8、速10L·min-1，干燥氣體溫度350℃，掃描方式為選擇性離子監(jiān)測，CPm/z260.9→139.9，碰撞能量20單位，裂解電壓115V，四級桿捕捉時間0.2s，異環(huán)磷酰胺(IFO)m/z260.9→153.8，碰撞能量21單位，裂解電壓115V，四級桿捕捉時間0.2s，電子倍增器300V，進(jìn)樣量為1μl。
　　 5.肝微粒體制備在完成MTX、5-FU和CP藥動學(xué)后，取抑郁組和對照組大鼠各9只，斷頭處死，迅速打開腹腔，取出肝臟

9、，用4℃的0.9％的生理鹽水洗凈表面血污，稱取1g左右的肝臟，剪碎。加入0.05mol.1-1Tris-0.25mol.1-1蔗糖(pH7.5)緩沖溶液于冰浴下將其制成勻漿液，4℃下先后以轉(zhuǎn)速為10000×g和105000×g離心制備肝微粒體，將其重混懸于1ml上述緩沖溶液中，-80℃保存?zhèn)溆谩２捎肂CA法測定肝微粒體中總蛋白的濃度。
　　 細(xì)胞色素P450酶系濃度和活性測定采用一氧化碳示差光譜法測定P450酶系的濃度。采用上海

10、杰美(Gen-Med)生物技術(shù)公司熒光定量檢測試劑法，以乙氧基香豆素（7-ethoxycoumarin）為底物測定乙氧基香豆素脫乙基酶(7-ethoxycoumarin-O-deacthylase，ECOD)活性，代表P450酶系的活性。
　　 6.數(shù)據(jù)處理采用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件和excel2007對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有結(jié)果均以(x)±s表示，P＜0.05為差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:1.模型建立抑

11、郁組大鼠在造模前后行為學(xué)的水平運動得分分別為81.81±10.57和15.00±5.44，垂直運動得分分別為14.63±3.90和4.81±2.06，造模前后血漿中5-HT濃度分別為6.07±1.55和2.13±0.66ng·ml-1:對照組大鼠在造模前后行為學(xué)的水平運動得分分別為78.07±11.54和72.67±13.74，垂直運動得分分別為16.19±5.05和14.19±5.03，造模前后血漿中5-HT濃度分別為6.24±1.8

12、7和6.00±1.72ng·ml-1。造模前后兩組數(shù)據(jù)相減后采用兩獨立樣本t檢驗統(tǒng)計分析，與對照組相比，抑郁組大鼠行為學(xué)和血漿中5-HT濃度在造模后均存在顯著性差異（均有P=0.000＜0.05;n=27），證明造模成功。
　　 2.血藥濃度測定FPIA法測定MTX血漿濃度的檢測試劑盒指控穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)品濃度準(zhǔn)確，HPLC法和HPLC-MS/MS法測定5-FU和CP血漿濃度方法學(xué)精密度、準(zhǔn)確度以及穩(wěn)定性良好(RSD％＜3)。所得MT

13、X、5-FU和CP血漿濃度數(shù)據(jù)真實可靠。
　　 3.血藥濃度-時間曲線和藥動學(xué)抑郁組和對照組大鼠血漿MTX濃度基本一致，血藥濃度-時間曲線也幾乎相同，采用兩獨立樣本t檢驗統(tǒng)計分析兩組大鼠的MTX藥動學(xué)參數(shù)，均無顯著性差異(P＞0.05，n=9);兩組大鼠血漿5-FU和CP濃度均存在差異，抑郁組大鼠各個時間點的5-FU和CP濃度幾乎均顯著低于正常組，采用兩獨立樣本t檢驗統(tǒng)計分析兩組大鼠的5-FU和CP藥動學(xué)參數(shù)，Cmax、t1/2

14、β、AUC(0-∞、MRT(0-∞)、CL值均存在顯著性差異(P＜0.05;n=9)。
　　 4.細(xì)胞色素P450酶系濃度和活性抑郁組大鼠肝微粒體中細(xì)胞色素P450酶系總濃度和總活性均顯著高于對照組，對兩組大鼠肝微粒體中細(xì)胞色素P450酶系總濃度和總活性數(shù)據(jù)進(jìn)行兩獨立樣本t檢驗統(tǒng)計分析，均存在顯著性差異(P＜0.05，n=9)。
　　 結(jié)論:抑郁心境障礙改變5-FU和CP在SD大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)，增加肝微粒中細(xì)胞色素P45