小細(xì)胞性B-NHL和DLBCL中IgVH基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的初步分析.pdf

1、本研究主要對小細(xì)胞性B-NHL(SBCLs)和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)這兩種B-NHL的VH基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，鑒別其VH基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與淋巴瘤的發(fā)病、發(fā)展是否存在聯(lián)系。 研究材料：收集1997-2005年我醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及省內(nèi)其它醫(yī)院的B-NHL標(biāo)本110例，其中SBCLs71例，DLBCL39例。全部標(biāo)本經(jīng)10％中性福爾馬林固定、常規(guī)石蠟包埋、4～5μm連續(xù)切片、HE染色。 研究方法 (1)免疫組化。

2、 采用CD20(L26)、CD45RA(4KB5)免疫組化S-P法標(biāo)記39例DLBCL和71例SBCLs，明確診斷。CD23(M0763)、CD5(M7194)、CyclinD1(M7155)、IgD(M0703)、BCL-6(PG-B6P)、FDC(CNA42)標(biāo)記SBCLs亞群。 (2)PCR擴(kuò)增和克隆。 通過半巢式PCR擴(kuò)增VH基因，上游引物為：tgga/gtccgc/acagg/cct/ct/ccngg(

3、FR2A)；下游引物為：tgaggagacggtgacc(LJH)和gtgaccagggt(a/g/c/t)ccttggccccag(VLJH)。PCR過程中設(shè)立陽性對照和陰性對照：陽性對照是Raji細(xì)胞株，陰性對照為不加任何DNA模板的反應(yīng)體系。所有病例的PCR產(chǎn)物均采用雙向測序。 將瓊脂糖凝膠電泳中的目的條帶割膠純化后進(jìn)行TA克隆。每個(gè)樣本至少隨機(jī)挑選5個(gè)克隆進(jìn)行測序分析。 (3)序列的分析方法。 運(yùn)用NCB

4、I的序列分析軟件將我們的測序結(jié)果與胚系序列比對，分析其同源性。VH、DH、JH片段主要通過V-Base數(shù)據(jù)庫和NCBI中的IgBlast軟件進(jìn)行界定。 (4)克隆內(nèi)多樣性的分析方法。 為了評價(jià)淋巴瘤是否存在持續(xù)超突變，每個(gè)樣本至少挑選5個(gè)克隆進(jìn)行測序?？寺?nèi)多樣性的評價(jià)遵循以下標(biāo)準(zhǔn)：非恒定的突變，指的是僅僅在樣本的單一克隆中出現(xiàn)的點(diǎn)突變；恒定突變，指的是在同一樣本的兩個(gè)以上克隆內(nèi)均出現(xiàn)的點(diǎn)突變。只有恒定突變被認(rèn)為是克隆內(nèi)

5、多樣性的標(biāo)記；非恒定突變則被認(rèn)為是Taq聚合酶誤配所引起?？寺?nèi)多樣性的頻率計(jì)算為：克隆內(nèi)突變的核苷酸數(shù)目/(序列總的核苷酸數(shù)×選取的克隆數(shù))。 (5)抗原選擇的分析方法。 評價(jià)某一病例的SHM形式是否符合抗原選擇特征有2種方法。一、分析互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)和框架區(qū)3(FR3)區(qū)域的替代突變/沉默突變(R/S)比率。當(dāng)CDR2中R/S大于2.9且FR3中的R/S小于1.5時(shí)，則認(rèn)為這一序列的SHM符合抗原選擇。二、僅

6、僅考慮FR3中的R/S，即當(dāng)FR3中R/S小于1.6便認(rèn)為該序列符合抗原選擇特征。 研究結(jié)果： 根據(jù)腫瘤的免疫表型和形態(tài)學(xué)特征，對71例SBCLs進(jìn)行鑒別診斷，得到MALT37例，DLBCL伴MALT區(qū)域9例，F(xiàn)L7例，MCL9例，NMZL2例，SMZL3例，剩余4例未明確診斷。將明確診斷的MALT(共37例)、DLBCL伴MALT(9例)以及39例DLBCL病例全部行PCR擴(kuò)增其VH片段，結(jié)果10例MALT和10例DL

7、BCL成功擴(kuò)增了IgVH基因的CDR2和FR3區(qū)域，并直接測序。將含有殘留MALT成分的DLBCL病例分別擴(kuò)增其兩種細(xì)胞群的VH基因，并對成功擴(kuò)增的病例進(jìn)行克隆測序。1例DLBCL伴MALT的DLBCL細(xì)胞群和1例DLBCL伴MALT的MALT成分成功進(jìn)行了克隆測序(討論SHM頻率時(shí)分別納入DLBCL和MALT的范疇)。此外對單純的4例MALT和5例DLBCL也進(jìn)行克隆測序，分析其克隆內(nèi)超突變情況。 (1)本研究的MALT病例中

8、有7例使用了VH3基因家族，3例使用VH4基因家族。VH3基因家族的使用率高達(dá)64％，比正常外周血中VH3的使用率(50％)高。DLBCL中7例VH3，4例VH4-34。在這個(gè)僅僅10個(gè)病例構(gòu)成的小樣本中VH4-34基因的使用率達(dá)到36％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常周圍血液。但是尚需要擴(kuò)大樣本研究才能對DLBCL中是否存在VH4-34基因家族的偏向性下結(jié)論。依據(jù)Corbett等人提出的規(guī)則：至少有10個(gè)連續(xù)的核苷酸與公認(rèn)的胚系D基因片段相吻合。我們的

9、病例中可以識別出D片段的MALT和DLBCL病例各為5例。根據(jù)另外一條相對不那么嚴(yán)格的規(guī)則：至少有6個(gè)連續(xù)片段與胚系片段相吻合，或者7個(gè)片段吻合(中間可有一個(gè)不吻合)，則另外3例MALT和2例DLBCL也可以辨別出D片段。當(dāng)病例的D片段與多個(gè)胚系D片段有高度同源性時(shí)，優(yōu)先考慮與其后的JH片段有重疊的胚系D片段。我們病例的JH片段以JH5最常見，其中MALT中有5例，DLBCL中有4例，其次為JH4，JH6。 (2)以突變頻率超過

10、2％作為鑒定發(fā)生SHM的界線，所有的MALT和10例DLBCL病例均發(fā)生了SHM。剩余1例DLBCL與胚系序列的同源性＞98％，未發(fā)生SHM。在11例MALT中VH基因的突變頻率介于2.38％-20.79％，平均為9.58％。DLBCL突變頻率介于1.18％-13％，平均值為7.5％。對兩組淋巴瘤的VH基因SHM頻率的通過T檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不存在顯著差異(P=0.227，t=1.246)。這些病例的SHM分析發(fā)現(xiàn)大部分的突變?yōu)辄c(diǎn)突變，但是也存在

11、連續(xù)2個(gè)或3個(gè)核苷酸的替換，特別是在同一密碼子內(nèi)出現(xiàn)。此外在MALT病例7中還見到一處3個(gè)核苷酸的缺失片段。 (3)研究的22個(gè)病例均呈功能性VH重排，內(nèi)部未見終止密碼子，有編碼免疫球蛋白的潛在功能。根據(jù)上面提到的兩條規(guī)則，9例MALT和6例DLBCL呈現(xiàn)抗原選擇。 (4)有1例DLBCL伴MALT病例的MALT細(xì)胞群克隆測序成功，分析顯示它存在克隆內(nèi)多樣性，克隆內(nèi)超突變的頻率為0.35％。另1病例的DLBCL細(xì)胞群擴(kuò)增

12、成功，對其挑選了8個(gè)克隆進(jìn)行測序，未發(fā)現(xiàn)克隆內(nèi)SHM。此外還對4例MALT病例以及5例胃腸道DLBCL進(jìn)行克隆測序。其中2例MALT(其中1例位于扁桃體)以及2例胃腸道DLBCL未見克隆內(nèi)多樣性，而另2例MALT和3例DLBCL存在克隆內(nèi)多樣性。 研究結(jié)論： (1)本組實(shí)驗(yàn)中的MALT來自GC后B細(xì)胞，其超突變的平均頻率為9.58％，比國外文獻(xiàn)報(bào)道的4-4.5％要高。 (2)DLBCL存在多源性，即可以來自GC前