FISH結(jié)合PCR-GeneScan及突變分析在B-NHL及PRCC分子病理特征中的研究.pdf

1、淋巴瘤的分類與診斷一直是病理界的一大難題，其分類復(fù)雜，誤診率也居高不下。常規(guī)診斷主要依賴病理形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)的方法，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，依據(jù)現(xiàn)代細(xì)胞和分子遺傳最新成果，2001年世界衛(wèi)生組織(WHO)出版了《造血和淋巴組織腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)》一書(shū)，2008年，又進(jìn)一步修訂出版了第4版《造血和淋巴組織腫瘤》。該書(shū)對(duì)多種淋巴瘤進(jìn)行了重新歸納，增加了許多新類型和亞型，為臨床和病理診斷提供了更加客觀和科學(xué)的依據(jù)和指南。
　　

2、 免疫球蛋白重鏈(IgH)基因是在成熟B細(xì)胞中正常表達(dá)的基因，位于14q32.3，全長(zhǎng)1250kb。在淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟的正常生理過(guò)程中，依靠重組酶的作用，IgH基因中4個(gè)分離的編碼序列，即可變區(qū)(V)、多變區(qū)(D)、連接區(qū)(J)和恒定區(qū)(C)將發(fā)生隨機(jī)重排，組合成為一個(gè)有結(jié)構(gòu)的基因，即基因重排。由于重排的隨機(jī)性及重排時(shí)隨機(jī)加入的堿基，從理論來(lái)說(shuō)，每個(gè)B細(xì)胞有其獨(dú)一無(wú)二的IgH基因。惡性B細(xì)胞淋巴瘤表達(dá)克隆性重排的Ign基因，而反應(yīng)性增

3、生的B細(xì)胞表達(dá)的IgH基因?yàn)槎嗫寺≈嘏?。因此，IgH基因的單克隆重排可以作為腫瘤細(xì)胞標(biāo)記而用于B-NHL診斷和鑒別診斷，甚至微小殘留腫瘤組織的監(jiān)測(cè)。而PCR基礎(chǔ)上的基因掃描(GeneScan)技術(shù)，通過(guò)熒光標(biāo)記的PCR引物，利用基因掃描計(jì)算機(jī)分析軟件，詳細(xì)分析IgH基因的重排情況，這種技術(shù)高度敏感，可以探測(cè)到0.5-1％的克隆性淋巴細(xì)胞。同時(shí)，它也有高度的分辨率，可以檢測(cè)出相差1bp長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物。
　　 已有研究資料表明：不

4、同淋巴瘤與染色體的轉(zhuǎn)位、缺失、擴(kuò)增等異常相關(guān)，從而造成原癌基因的激活，腫瘤抑制基因的失活，及產(chǎn)生具有功能性原癌基因活性的融合基因。在多數(shù)成熟B細(xì)胞腫瘤，染色體的轉(zhuǎn)位引起癌基因與成熟B細(xì)胞正常表達(dá)基因(多為Ig基因)的調(diào)節(jié)序列(Juxtapose)對(duì)合，造成翻譯失調(diào)。如t(14，18)造成IgH和BCL-2易位是大多數(shù)濾泡性淋巴瘤(FL)的特征，這種易位使凋亡抑制蛋白BCL-2大量表達(dá)；DLBCL中可見(jiàn)多種染色體異常，約40％與BCL-6

5、基因有關(guān)，20-30％與BCL-2基因有關(guān)；約30％的MALT淋巴瘤與t(11，18)產(chǎn)生的MALT1基因有關(guān)。熒光原位雜交(FISH)技術(shù)通過(guò)熒光標(biāo)記的探針與染色體上的靶目標(biāo)結(jié)合，以發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)基因的突變、缺失和轉(zhuǎn)位，具有靈敏度高、直觀、準(zhǔn)確等特點(diǎn)。
　　 我們以FR3A/FR2A/LJH/VLJH為引物對(duì)44例B-NHL進(jìn)行PCR-瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)FR3A單一條帶39例，比率為88.6％；FR2A單一條帶28例，比率

6、為67.6％；FR3A和/或FR2A單一條帶40例，比率為90.9％。對(duì)瓊脂糖凝膠電泳為單一條帶的病例進(jìn)一步進(jìn)行基因掃描檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)FR3A克隆性重排占56.4％(其中單克隆重排14例，雙克隆重排8例)，非克隆性重排占43.6％(其中寡克隆重排7例，多克隆重排10例)。FR2A克隆性重排占55.6％(其中單克隆重排12例，雙克隆重排3例)，非克隆性重排占44.4％(其中寡克隆重排4例，多克隆重排7例)。FR3A和/或FR2A聯(lián)合檢測(cè)克隆性

7、重排占61.5％(其中單克隆重排17例，雙克隆重排7例)，非克隆性重排占38.5％(其中寡克隆重排7例，多克隆重排8例)。
　　 對(duì)其中35例DLBCL進(jìn)行FISH檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)IgH基因發(fā)生斷裂的有22例(62.9％)，其中5例發(fā)生在GCB型(5/10)，17例發(fā)生在非GCB型(17/25)。BCL-6基因發(fā)生斷裂的有9例(25.7％)，其中3例發(fā)生在GCB型(3/10)，6例發(fā)生在非GCB型(6/25)。BCL-2基因斷裂和Ig

8、H/BCL2易位均僅在1例病例中檢測(cè)到(2.9％)，且為同一例病例(GCB型)，而35例DLBCL中約有43％的病例發(fā)生了BCL-2的擴(kuò)增。另外，8例MALT淋巴瘤2例(25％)檢測(cè)到MALTI基因斷裂。2例FL有1例檢測(cè)到BCL-2基因斷裂。
　　 結(jié)合FISH和PCR-GeneScan技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)15例寡克隆或多克隆重排的B-NHL病例中有8例相關(guān)基因發(fā)生了特異性改變。其中11例IgH寡克隆和多克隆重排的DLBCL病例中，

9、有7例利用FISH檢測(cè)到IgH基因發(fā)生了斷裂，1例IgH多克隆重排的FL病例經(jīng)FISH檢測(cè)BCL-2基因發(fā)生斷裂。另外，4例IgH重排PCR擴(kuò)增檢測(cè)陰性的DLBCL病例經(jīng)FISH檢測(cè)，4例病例IgH基因均發(fā)生了斷裂，3例(3/4)發(fā)生了BCL-6基因斷裂，BCL-2基因雖未檢測(cè)到斷裂，但其中2例檢測(cè)到BCL-2基因擴(kuò)增。兩種技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用使淋巴瘤分子診斷的陽(yáng)性檢出率由61.5％提高到81.8％。
　　 綜上所述，PCR-瓊脂糖凝

10、膠電泳可作為IgH克隆重排檢測(cè)的初篩，PCR-GeneScan檢測(cè)可以進(jìn)一步明確IgH重排的類型，對(duì)于淋巴瘤的診斷和鑒別診斷具有十分重要的意義。雙色分離探針無(wú)關(guān)易位伴侶基因的情況，可作為FISH檢測(cè)染色體異常的初篩，進(jìn)一步的雙色融合探針有助于不同淋巴瘤類型的診斷。國(guó)人DLBCL中IgH/BCL2易位極低的檢出率及較高的BCL-2基因擴(kuò)增可能與國(guó)人DLBCL中較低的GCB亞型有關(guān)。分子診斷技術(shù)必須結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)、免疫組化及其他檢測(cè)指標(biāo)，單