FISH結合PCR-GeneScan及突變分析在B-NHL及PRCC分子病理特征中的研究.pdf

1、淋巴瘤的分類與診斷一直是病理界的一大難題，其分類復雜，誤診率也居高不下。常規(guī)診斷主要依賴病理形態(tài)學和免疫組織化學的方法，隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，依據(jù)現(xiàn)代細胞和分子遺傳最新成果，2001年世界衛(wèi)生組織(WHO)出版了《造血和淋巴組織腫瘤病理學和遺傳學》一書，2008年，又進一步修訂出版了第4版《造血和淋巴組織腫瘤》。該書對多種淋巴瘤進行了重新歸納，增加了許多新類型和亞型，為臨床和病理診斷提供了更加客觀和科學的依據(jù)和指南。
　　

2、 免疫球蛋白重鏈(IgH)基因是在成熟B細胞中正常表達的基因，位于14q32.3，全長1250kb。在淋巴細胞發(fā)育成熟的正常生理過程中，依靠重組酶的作用，IgH基因中4個分離的編碼序列，即可變區(qū)(V)、多變區(qū)(D)、連接區(qū)(J)和恒定區(qū)(C)將發(fā)生隨機重排，組合成為一個有結構的基因，即基因重排。由于重排的隨機性及重排時隨機加入的堿基，從理論來說，每個B細胞有其獨一無二的IgH基因。惡性B細胞淋巴瘤表達克隆性重排的Ign基因，而反應性增

3、生的B細胞表達的IgH基因為多克隆重排。因此，IgH基因的單克隆重排可以作為腫瘤細胞標記而用于B-NHL診斷和鑒別診斷，甚至微小殘留腫瘤組織的監(jiān)測。而PCR基礎上的基因掃描(GeneScan)技術，通過熒光標記的PCR引物，利用基因掃描計算機分析軟件，詳細分析IgH基因的重排情況，這種技術高度敏感，可以探測到0.5-1％的克隆性淋巴細胞。同時，它也有高度的分辨率，可以檢測出相差1bp長度的PCR產(chǎn)物。
　　 已有研究資料表明：不

4、同淋巴瘤與染色體的轉位、缺失、擴增等異常相關，從而造成原癌基因的激活，腫瘤抑制基因的失活，及產(chǎn)生具有功能性原癌基因活性的融合基因。在多數(shù)成熟B細胞腫瘤，染色體的轉位引起癌基因與成熟B細胞正常表達基因(多為Ig基因)的調節(jié)序列(Juxtapose)對合，造成翻譯失調。如t(14，18)造成IgH和BCL-2易位是大多數(shù)濾泡性淋巴瘤(FL)的特征，這種易位使凋亡抑制蛋白BCL-2大量表達；DLBCL中可見多種染色體異常，約40％與BCL-6

5、基因有關，20-30％與BCL-2基因有關；約30％的MALT淋巴瘤與t(11，18)產(chǎn)生的MALT1基因有關。熒光原位雜交(FISH)技術通過熒光標記的探針與染色體上的靶目標結合，以發(fā)現(xiàn)疾病相關基因的突變、缺失和轉位，具有靈敏度高、直觀、準確等特點。
　　 我們以FR3A/FR2A/LJH/VLJH為引物對44例B-NHL進行PCR-瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)FR3A單一條帶39例，比率為88.6％；FR2A單一條帶28例，比率

6、為67.6％；FR3A和/或FR2A單一條帶40例，比率為90.9％。對瓊脂糖凝膠電泳為單一條帶的病例進一步進行基因掃描檢測，發(fā)現(xiàn)FR3A克隆性重排占56.4％(其中單克隆重排14例，雙克隆重排8例)，非克隆性重排占43.6％(其中寡克隆重排7例，多克隆重排10例)。FR2A克隆性重排占55.6％(其中單克隆重排12例，雙克隆重排3例)，非克隆性重排占44.4％(其中寡克隆重排4例，多克隆重排7例)。FR3A和/或FR2A聯(lián)合檢測克隆性

7、重排占61.5％(其中單克隆重排17例，雙克隆重排7例)，非克隆性重排占38.5％(其中寡克隆重排7例，多克隆重排8例)。
　　 對其中35例DLBCL進行FISH檢測，發(fā)現(xiàn)IgH基因發(fā)生斷裂的有22例(62.9％)，其中5例發(fā)生在GCB型(5/10)，17例發(fā)生在非GCB型(17/25)。BCL-6基因發(fā)生斷裂的有9例(25.7％)，其中3例發(fā)生在GCB型(3/10)，6例發(fā)生在非GCB型(6/25)。BCL-2基因斷裂和Ig

8、H/BCL2易位均僅在1例病例中檢測到(2.9％)，且為同一例病例(GCB型)，而35例DLBCL中約有43％的病例發(fā)生了BCL-2的擴增。另外，8例MALT淋巴瘤2例(25％)檢測到MALTI基因斷裂。2例FL有1例檢測到BCL-2基因斷裂。
　　 結合FISH和PCR-GeneScan技術，我們發(fā)現(xiàn)15例寡克隆或多克隆重排的B-NHL病例中有8例相關基因發(fā)生了特異性改變。其中11例IgH寡克隆和多克隆重排的DLBCL病例中，

9、有7例利用FISH檢測到IgH基因發(fā)生了斷裂，1例IgH多克隆重排的FL病例經(jīng)FISH檢測BCL-2基因發(fā)生斷裂。另外，4例IgH重排PCR擴增檢測陰性的DLBCL病例經(jīng)FISH檢測，4例病例IgH基因均發(fā)生了斷裂，3例(3/4)發(fā)生了BCL-6基因斷裂，BCL-2基因雖未檢測到斷裂，但其中2例檢測到BCL-2基因擴增。兩種技術的聯(lián)合應用使淋巴瘤分子診斷的陽性檢出率由61.5％提高到81.8％。
　　 綜上所述，PCR-瓊脂糖凝

10、膠電泳可作為IgH克隆重排檢測的初篩，PCR-GeneScan檢測可以進一步明確IgH重排的類型，對于淋巴瘤的診斷和鑒別診斷具有十分重要的意義。雙色分離探針無關易位伴侶基因的情況，可作為FISH檢測染色體異常的初篩，進一步的雙色融合探針有助于不同淋巴瘤類型的診斷。國人DLBCL中IgH/BCL2易位極低的檢出率及較高的BCL-2基因擴增可能與國人DLBCL中較低的GCB亞型有關。分子診斷技術必須結合傳統(tǒng)形態(tài)學、免疫組化及其他檢測指標，單