B-NHL中LgVH克隆重排及分子特征的研究.pdf

1、惡性淋巴瘤發(fā)病的分子機(jī)制是當(dāng)前腫瘤研究的熱點(diǎn)。惡性淋巴瘤作為我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤之一,從分子病理學(xué)和分子遺傳學(xué)水平來(lái)探討其相關(guān)基因的特征和發(fā)病機(jī)制,以期建立相應(yīng)的分子標(biāo)記,進(jìn)一步協(xié)助診斷、判斷預(yù)后、并為進(jìn)一步的預(yù)防提供新思路,已成為目前國(guó)內(nèi)外淋巴瘤研究的主要方向。
　　 免疫球蛋白重鏈(IgH)基因是成熟B細(xì)胞正常表達(dá)的基因。在正常淋巴細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中,IgH基因的4個(gè)分離的編碼序列,即可變區(qū)(V)、多變區(qū)(D)、連接區(qū)(J)和恒定

2、區(qū)(C)會(huì)發(fā)生隨機(jī)重排組合成一個(gè)有結(jié)構(gòu)的基因。組合后的IgH基因主要包括三個(gè)框架區(qū)(FRs)和三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)。IgH基因的重排形式是淋巴瘤最重要的輔助診斷之一,而且其重鏈可變區(qū)(IgVH)的突變狀態(tài)可反映B細(xì)胞腫瘤的起始來(lái)源,進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)IgVH基因的突變狀態(tài)與某些淋巴瘤的惡性程度及預(yù)后相關(guān)。
　　 在生發(fā)中心的發(fā)育過(guò)程中,遭遇抗原的識(shí)別主要發(fā)生在互補(bǔ)決定區(qū),發(fā)生體細(xì)胞超突變(SHM)。在此期間,Ig基因的V段產(chǎn)

3、生高頻點(diǎn)突變,致使B細(xì)胞產(chǎn)生高親合力的IG分子。這個(gè)過(guò)程易受內(nèi)、外因素(如個(gè)體遺傳差異、病毒感染等)干擾而出現(xiàn)差異,構(gòu)成了淋巴瘤發(fā)生的重要高危因素。SHM是B細(xì)胞發(fā)展階段的一個(gè)重要標(biāo)志,目前認(rèn)為Ig的SHM是細(xì)胞來(lái)源于生發(fā)中心的標(biāo)記。IgVH基因的SHM分析使得人們對(duì)B細(xì)胞和其惡性腫瘤的發(fā)展過(guò)程以及一些B細(xì)胞腫瘤的亞型有了更深刻的了解。研究還發(fā)現(xiàn)不同的淋巴瘤所使用的VH基團(tuán)家族存在著差別,有的淋巴瘤對(duì)特定的VH基因家族有著特殊的偏好,即

4、所謂的VH基因偏向性使用,這一分子遺傳學(xué)上的特征在淋巴瘤發(fā)病中的意義也值得深入研究。
　　 近年來(lái)國(guó)外學(xué)者利用基因掃描(Genescan)技術(shù),可精準(zhǔn)分析IgVH基因的克隆重排狀態(tài),歸納重排類型,比常規(guī)PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)更加精確,國(guó)外已經(jīng)將它作為分子病理診斷的常規(guī)項(xiàng)目。目前國(guó)內(nèi)尚開(kāi)展的較少,本研究將對(duì)PCR基礎(chǔ)上的基因掃描技術(shù)在淋巴瘤診斷中的應(yīng)用進(jìn)行探討。
　　 我們采用通用引物FR3A和FR2A,檢測(cè)了70例常見(jiàn)

5、類型的B-NHL(主要包括DLBCL、MALT、FL、MCL及CLL)的IgVH基因克隆重排,其中63例用FR3A引物檢測(cè)陽(yáng)性,陽(yáng)性率90.0％;38例用FR2A引物檢測(cè)陽(yáng)性,陽(yáng)性率54.3％;65例用FR3A或者FR2A引物檢測(cè)陽(yáng)性,陽(yáng)性率92.9％。
　　 基因掃描可以快速有效地區(qū)分相同或不同克隆的PCR產(chǎn)物。我們用熒光染料標(biāo)記上游引物(或下游引物),采用DNA分析儀以及GeneMapper軟件(GeneMapper3.1,

6、ABI)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。在研究中我們發(fā)現(xiàn),瓊脂糖凝膠電泳下顯示為單條條帶的病例經(jīng)基因掃描檢測(cè)后,單克隆重排及雙克隆重排檢出率只有70％左右。通過(guò)對(duì)瓊脂糖凝膠電泳與基因掃描檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行比較,我們發(fā)現(xiàn)瓊脂糖電泳檢測(cè)為單條條帶的病例,基因掃描檢測(cè)結(jié)果并不為單克隆重排,以FR3A為例,其中雙克隆重排6例,寡克隆重排3例,多克隆重排3例;而作為對(duì)照的慢性扁桃炎有時(shí)在凝膠電泳下也為單條條帶,經(jīng)基因掃描檢測(cè)后明確了其多克隆重排的特征。這一結(jié)果

7、說(shuō)明常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)重排不能用于判斷淋巴瘤的克隆重排類型。而PCR基礎(chǔ)上的基因掃描技術(shù)能夠彌補(bǔ)這一缺陷,成為淋巴瘤分子診斷的重要手段。在國(guó)外它已經(jīng)被作為淋巴瘤診斷的常規(guī)檢測(cè)方法,而國(guó)內(nèi)尚有待開(kāi)展。
　　 我們把FR2A陽(yáng)性的DLBCL病例進(jìn)行測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果和IgBLAST數(shù)據(jù)庫(kù)上的序列比對(duì)分析,進(jìn)一步探討DLBCL中IgVH基因的分子特征。本研究中測(cè)序成功17例DLBCL(17/52),免疫組化結(jié)果顯示3例為生發(fā)中

8、心型DLBCL,其余14例均為非生發(fā)中心型DLBCL,測(cè)序結(jié)果顯示它們都攜帶突變型IgVH基因,都為生發(fā)中心或生發(fā)中心后的DLBCL,主要表現(xiàn)為核苷酸的替換。
　　 目前對(duì)DLBCL中VH基因的偏向性使用還存在著爭(zhēng)議,Lossos等人對(duì)53例VH片段的偏向性分析發(fā)現(xiàn)DLBCL所攜帶的VH基因家族比率與正常血液中的B細(xì)胞相似。而也有相反的報(bào)道認(rèn)為DLBCL中有VH4-34的偏向性使用。本研究測(cè)序成功的17例DLBCL中,3例雙克隆

9、樣本的VH片段都來(lái)自VH3和VH4家族,其余樣本中,7例使用VH4家族(且VH4-34和VH4-61出現(xiàn)的頻率最高),6例使用VH3家族。此小樣本研究顯示DLBCL傾向使用VH4和VH3家族,還需要擴(kuò)大樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
　　 綜上所述,我們利用PCR凝膠電泳結(jié)合基因掃描技術(shù)檢測(cè)B-NHL中IgVH基因的克隆性重排,顯示PCR基礎(chǔ)上的基因掃描技術(shù)能夠用于B細(xì)胞淋巴瘤IgVH基因的重排類型,是淋巴瘤的分子診斷的重要手段。此外,我們結(jié)合