細絲蛋白B在基因轉(zhuǎn)錄、細胞增殖和遷移中的功能研究.pdf

1、細絲蛋白B(Filamin B，F(xiàn)LNB)由第3號常染色體上的基因編碼，是細胞骨架蛋白，它與肌動蛋白交聯(lián)形成三維細胞骨架網(wǎng)絡(luò)并維持細胞形態(tài)，在細胞中參與多種生理生化活動，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細胞增殖等。近年來的研究表明，細絲蛋白A和細絲蛋白B在腫瘤發(fā)生、骨骼疾病、細胞遷移以及粘附過程中起關(guān)鍵作用;本實驗室以前的研究表明，細絲蛋白A(FLNA)能夠抑制RNA聚合酶Ⅰ(PolⅠ)指導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，并且通過細胞特異性的調(diào)節(jié)方式抑制RNA聚合酶Ⅲ(Po

2、lⅢ)指導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，進而抑制細胞增殖。由于FLNB和FLNA都屬于細絲蛋白家族，初級結(jié)構(gòu)上具有80％的同源性，且在細胞內(nèi)共定位，因此，在本課題中，我們試圖了解FLNB是否也參與PolⅠ和PolⅢ基因轉(zhuǎn)錄過程并影響細胞的增殖和遷移功能。
　　為了完成以上研究目標(biāo)，首先，我們制備了FLNB shRNA慢病毒表達系統(tǒng)，利用制備的慢病毒表達顆粒侵染293T和HeLa細胞并篩選出FLNB shRNA穩(wěn)定表達細胞系。利用RT-qPCR分析這

3、些細胞系中PolⅠ和PolⅢ指導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，結(jié)果表明，F(xiàn)LNB敲低能夠顯著降低所檢測的一部分基因的RNA表達水平;提示FLNB是PolⅠ和PolⅢ指導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄所需要的。為了確定這一發(fā)現(xiàn)，利用293T和HeLa細胞過表達FLNB，結(jié)果表明，F(xiàn)LNB過表達顯著增加核糖體RNA，U6snRNA以及7SL RNA表達水平。這些結(jié)果證明FLNB是維持PolⅠ和PolⅢ正常基因轉(zhuǎn)錄所必需的。由于FLNA敲低能促進細胞中PolⅠ和PolⅢ基因轉(zhuǎn)錄，

4、因此，在FLNB敲低的基礎(chǔ)上再次敲降FLNA是否挽救因FLNB敲低導(dǎo)致的基因表達抑制，利用FLNB-FLNA雙敲低細胞系以及qPCR方法，數(shù)據(jù)表明，一部分受FLNB敲低抑制的基因的表達水平有不同程度的上調(diào)。這一結(jié)果提示FLNB與FLNA在調(diào)控PolⅠ和PolⅢ基因轉(zhuǎn)錄功能上起著相反的作用。
　　由于PolⅠ和PolⅢ基因轉(zhuǎn)錄和細胞增殖密切相關(guān)，因此，我們試圖確定FLNB表達水平的改變是否影響細胞增殖。通過對上述細胞株在不同時間進行

5、細胞計數(shù)和MTT實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LNB敲低抑制細胞增殖，而FLNB過表達則促進細胞的增殖。FLNB是否調(diào)節(jié)細胞的遷移還不清楚，因此我們通過細胞劃痕和Transwell實驗分析FLNB表達水平的改變對上述細胞遷移能力的影響。結(jié)果表明，F(xiàn)LNB敲低抑制細胞遷移，而FLNB過表達促進細胞遷移。進一步對FLNA敲低細胞系及FLNB-FLNA雙敲低細胞系的增殖和遷移功能的分析表明，在293T、HeLa細胞中，F(xiàn)LNA與FLNB在調(diào)控細胞增殖和遷移功能

6、上起相反的作用;FLNA抑制細胞增殖和遷移，而FLNB促進細胞增殖和遷移。與FLNB敲低細胞系相比，雖然FLNB-FLNA雙敲低細胞系的增殖水平表現(xiàn)出一定程度升高，但雙敲低細胞系的遷移能力則表現(xiàn)出的下降趨勢。這一結(jié)果顯示，當(dāng)同時敲低293T、HeLa細胞中的FLNB后再敲低FLNA，F(xiàn)LNA在細胞遷移方面起正調(diào)控作用，提示FLNA對細胞遷移的調(diào)節(jié)作用依賴于FLNB的表達。綜合以上數(shù)據(jù)，本課題發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LNB是維持細胞PolⅠ和PolⅢ正常