EphrinA5在小鼠顆粒細胞中的功能和轉(zhuǎn)錄組學研究及其蛋白結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、本論文試驗研究由三部分組成。第一部分分析肝配蛋白A5（EphrinA5）在小鼠顆粒細胞中的生理作用和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑;第二部分探討肝配蛋白A5的全基因組效應(yīng);第三部分分析鼠源肝配蛋白A5及其受體蛋白結(jié)構(gòu)。
　　實驗Ⅰ:肝配蛋白A5對小鼠原代顆粒細胞凋亡和增殖的調(diào)控作用及新的信號通路
　　最新研究結(jié)果表明，肝配蛋白A5除了作為神經(jīng)發(fā)生因子發(fā)揮生理作用外，還在雌性小鼠繁殖過程中具有重要生物學作用，但在顆粒細胞(GC)中的生物學作用尚

2、不清楚。GC是研究卵泡發(fā)育基因功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的理想模型。本研究結(jié)果表明，肝配蛋白A5的表達在各年齡組小鼠GC中有差異。干擾肝配蛋白A5基因引起mRNA水平和蛋白質(zhì)水平表達下調(diào)，同時抑制E游受體EphA5、Epha3、Epha8和Ephb2的mRNA表達。在體外水平，肝配蛋白A5的下調(diào)表達抑制小鼠GC細胞凋亡過程。為了揭示肝配蛋白A5在調(diào)控GC凋亡中的作用，本研究進一步分析凋亡因子mRNA和蛋白水平的表達情況，發(fā)現(xiàn)Bax、Tnfα、Cas

3、pase-8和Caspase-3表達下調(diào)，而Bcl-2表達上調(diào)。這些結(jié)果表明，肝配蛋白A5通過Caspase-8介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑參與細胞凋亡。進一步敲低肝配蛋白A5的表達水平，引起Pcna表達上調(diào)，隨后激活p-Akt和p-ERK途徑來，促進GC增殖。此外，抑制肝配蛋白A5可增強BMH15、VEGFA和雌二醇mRNA表達水平，并且在不影響孕酮表達水平的情況下抑制GDF9表達，說明其參與卵泡血管生成和卵母細胞發(fā)育調(diào)控。綜上所述，肝配蛋白A5

4、調(diào)節(jié)雌性小鼠卵泡顆粒細胞凋亡、增殖和類固醇生成過程，因此是雌性生育障礙的潛在治療靶標。
　　實驗Ⅱ:小鼠顆粒細胞肝配蛋白A5干擾后的轉(zhuǎn)錄組分析
　　肝配蛋白A5是一種肝配蛋白-乙二醇苯醚(ephrin-Eph)信號分子，主要是神經(jīng)元因子。但最近的研究表明其生理作用超過了神經(jīng)發(fā)生，其在雌性生殖功能中尤其在卵泡發(fā)育中的作用日益受到關(guān)注。肝配蛋白A5與繁殖相關(guān)的研究處于初始階段，目前尚未從轉(zhuǎn)錄組水平報道肝配蛋白A5在卵巢顆粒細胞中

5、的作用。本研究研究利用肝配蛋白A5的siRNA處理小鼠顆粒細胞，然后進行轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)，以探索肝配蛋白A5干擾后顆粒細胞的全基因組圖譜。RNA-Seq分析結(jié)果表明，在小鼠顆粒細胞中檢測到16389個基因，與陰性對照相比，siRNA處理的細胞中有208個基因失調(diào)。其中，149個基因下調(diào)，59個基因上調(diào)。失調(diào)的基因主要富集在細胞外過程、鈣結(jié)合和細胞粘附。此外，它們主要參與了PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、細胞因子-細胞因子受體相

6、互作用、局灶性粘附和Rap1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等過程。總體而言，干擾肝配蛋白A5改變了調(diào)節(jié)卵泡發(fā)生的十多種基因的轉(zhuǎn)錄水平、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和生物學過程。本研究為肝配蛋白A5在神經(jīng)生物學外的雌性生殖中的作用研究提供了新的線索和研究思路。
　　實驗Ⅲ小鼠肝配蛋白A5及其受體的結(jié)構(gòu)分析
　　蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對于細胞功能至關(guān)重要，因此結(jié)構(gòu)的缺陷可能導(dǎo)致細胞功能紊亂。肝配蛋白A5受體屬于介導(dǎo)細胞通訊過程中最大的一類酪氨酸激酶家族。通過NCBI和蛋白質(zhì)資源

7、數(shù)據(jù)庫中檢索肝配蛋白A5（Efna5）、肝配蛋白A5受體3(Epha3)、肝配蛋白A5受體5(Epha5)和肝配蛋白A5受體B2(Ephb2)的氨基酸序列，評價和鑒定其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并預(yù)測候選蛋白的三維(3D)結(jié)構(gòu)。候選蛋白預(yù)測結(jié)構(gòu)存在輕微的構(gòu)象變化，采用ProSA軟件3D分數(shù)進一步分析預(yù)測模型的精度。Efna5、Epha3、Epha5和Ephb2的Verify3D分數(shù)分別為92.75％、94.77％、89.87％和85.96％，說明預(yù)測模

8、型結(jié)構(gòu)在可接受質(zhì)量范圍內(nèi)。蛋白質(zhì)結(jié)果無序性分析表明Efna5、Ephb3和Ephb2分別存在32.89％、25.4％和27.07％的殘基紊亂。配體結(jié)合位點分析結(jié)果表明，Efna5、Epha5、Epha3和Ephb2分別存在3、5、4和2個不同的氨基酸殘疾數(shù)目的配體分子。此外，預(yù)測到候選蛋白非結(jié)合區(qū)的3個結(jié)合位點。距離波動分析發(fā)現(xiàn)一些氨基酸殘基在下降和上升的波動中均存在。應(yīng)用互相關(guān)函數(shù)進一步分析發(fā)現(xiàn)這些候選蛋白均存在突變結(jié)構(gòu)。相互作用和通