轉(zhuǎn)錄相關(guān)鋅帶蛋白基因ZNRD1在胃癌耐藥細(xì)胞中的表達(dá)和功能分析.pdf

1、目的:克隆ZNRD1的編碼基因,鑒定其在胃癌長(zhǎng)春新堿耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR中的差異表達(dá),探討其功能及可能的作用機(jī)制.方法:(1)應(yīng)用Northern blot和半定量RT-PCR檢測(cè)鋅帶基因ZNRD1在胃癌細(xì)胞SGC7901及其耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR中RNA水平的差異表達(dá);(2)應(yīng)用RT-PCR從高表達(dá)ZNRD1的SGC7901/VCR細(xì)胞克隆ZNRD1編碼cDNA;(3)將ZNRD1基因的cDNA片段克隆入原核表達(dá)載體

2、,在大腸桿菌體內(nèi)進(jìn)行表達(dá);(4)利用Ni-NTA柱純化原核表達(dá)產(chǎn)物,并以純化的表達(dá)產(chǎn)物免疫新西蘭兔制備多克隆抗體;(5)用Westernblot鑒定制備的抗血清;(6)通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)ZNRD1基因在胃癌細(xì)胞和長(zhǎng)春新堿耐藥細(xì)胞蛋白水平的差異表達(dá);(7)采用分子克隆技術(shù),構(gòu)建反義核酸,將ZNRD1基因全長(zhǎng)cDNA片段按反方向克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1的多克隆位點(diǎn)之間,用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染SGC7901/VCR細(xì)胞,點(diǎn)印跡方法

3、檢測(cè)ZNRD1在轉(zhuǎn)染細(xì)胞及其對(duì)照細(xì)胞中的表達(dá);(8)通過(guò)流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞的細(xì)胞周期變化;(9)MTT實(shí)驗(yàn)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,進(jìn)行體外藥物敏感性分析,計(jì)算細(xì)胞對(duì)藥物的IC<,50>值和耐藥指數(shù)(resistance index,RI);(10)構(gòu)建正義表達(dá)載體,經(jīng)顯微注射導(dǎo)入SGC7901細(xì)胞,點(diǎn)印跡方法檢測(cè)ZNRD1在轉(zhuǎn)染細(xì)胞及其對(duì)照細(xì)胞中的表達(dá);(11)MTT實(shí)驗(yàn)進(jìn)行體外藥物敏感性分析;(12)通過(guò)流式細(xì)胞儀分析反義核酸

4、轉(zhuǎn)染細(xì)胞及其對(duì)照細(xì)胞的阿霉素蓄積量;(13)Western blot檢測(cè)細(xì)胞中耐藥相關(guān)分子MDR1、MRP、GST-π、MGr1的變化.結(jié)論:胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR與非耐藥細(xì)胞SGC7901相比,ZNRD1基因的RNA和蛋白水平均處于高表達(dá)狀態(tài).反義核酸轉(zhuǎn)染有效地降低了ZNRD1蛋白的表達(dá),可不同程度地使已產(chǎn)生耐藥腫瘤細(xì)胞的MDR表型發(fā)生逆轉(zhuǎn),參與了胃癌細(xì)胞MDR的形成.ZNRD1基因可能通過(guò)與Pgp和MGr1的作用而影響細(xì)